黄病毒和冠状病毒感染报告系统的建立和初步应用.pdfVIP

摘要

黄病毒和冠状病毒尤其是新型冠状病毒的大规模流行给人类健康和全球经济造成

了不可挽回的损失，目前这些病毒的感染致病机理仍有很多未知，预防和治疗效果亦不

够理想。考虑到多数病毒均具有严格的生物安全操作要求，尤其是黄病毒属的部分病毒

如黄热病毒和冠状病毒属的部分病毒如新型冠状病毒均需要在生物安全三级实验室操

作，限制了病毒感染致病机理、抗病毒药物和疫苗的研究，因此迫切需要建立直观、检

测方便、且易于在生物安全二级实验室操作的病毒感染报告模型。本研究选择黄热病毒

疫苗株YF-17D、人类冠状病毒NL63（HCoV-NL63）和新型冠状病毒（SARS-CoV-2）

为研究对象，利用荧光蛋白、荧光素酶等报告基因构建了三者的感染报告系统并进行了

药物筛选评价等初步应用。

本研究主要包含三部分内容：

1、重组黄热病毒疫苗株YF-17D-NG感染报告系统的建立与应用

利用反向遗传学从头合成5’UTR区含有绿色荧光蛋白mNeonGreen报告基因的重

组黄热病毒疫苗株YF-17D质粒，将其转染BHK-21细胞72h后收取病毒颗粒，在Vero

E6细胞上扩增5代，通过观测细胞绿色荧光强度检测荧光蛋白表达；通过检测YF-17D

的E蛋白表达情况验证病毒在细胞内稳定复制；通过空斑实验观测到扩增第5代的病毒

5

滴度可高达1.5×10PFU/mL。使用已知黄病毒小分子抑制剂作用于重组黄热病毒疫苗株

YF-17D-NG感染的细胞，通过对细胞荧光蛋白强度的变化情况，验证了该报告系统在抗

病毒药物筛选评价上具有更直观、更便捷的优势，凸显了该重组病毒报告系统的未来应

用价值。

2、基于慢病毒包装载体系统的新型冠状病毒假病毒应用

利用实验室前期建立基于慢病毒载体的SARS-CoV-2假病毒系统，评价了SARS-

CoV-2临床用抗体LY-CoV1404的耐药位点和未来临床应用价值。设计包装了三类

SARS-CoV-2假病毒：基于BA.5S蛋白的K444、V445和G446位点突变的假病毒；

BA.2.3.20、BQ.1.1和XBB.1等未来可能流行的假病毒；美国废水中发现的三个RBD代

表性SARS-CoV-2突变株；证明了新冠病毒S蛋白的K444位点附近突变严重影响临床

用抗体LY-CoV1404的活性，BQ.1.1和XBB.1均能显著逃逸LY-CoV1404的中和，此外

LY-CoV1404也不能中和美国废水中发现的三个RBD代表性SARS-CoV-2隐匿突变株，

未来该抗体已不适用于临床SARS-CoV-2的大规模治疗。

3、基于VSV双报告系统的HCoV-NL63假病毒的建立与应用

通过设计四种不同HCoV-NL63的S蛋白来优化HCoV-NL63假病毒报告系统，分

别是：（1）全长S蛋白；（2）C末端19个氨基酸被删除的S蛋白（SD）；（3）C末

端19个氨基酸被VSV-G标签替换的S蛋白（SV）；（4）C末端19个氨基酸被VSV-

G标签替换并携带I507L位点突变的S蛋白（SVN）。通过两种不同假病毒包装系统（慢

病毒包装系统和VSV包装系统），比较了4种不同S蛋白的假病毒包装效率，发现C

末端19个氨基酸被VSV-G标签替换后所包装的假病毒拥有更高的滴度，并且I507L位

点的突变可以进一步提高假病毒的感染活性，VSV包装系统包装的假病毒可大大提高

假病毒滴度达到慢病毒包装系统的50倍。成功构建了基于VSV双报告基因的HCoV-

NL63假病毒系统，通过该系统感染来源不同的细胞系，筛选出易感细胞，并利用易感

细胞成功进行了天然小分子侵染抑制剂的筛选，证明了该报告系统的实用性。

综上所述，本研究针对三种不同病毒的特点建立了基于真病毒和假病毒的两类基于

病毒感染报告系统，经优化后能够获得高滴度的感染性病毒/假病毒粒子。这些系统的成

功构建为病毒感染机制探究、侵染抑制剂筛选、疫苗研发等提供了直观、可靠、便利的

工具。

关键词：黄热病毒疫苗株YF-17D，新型冠状病毒，人类冠状病毒NL63，反向遗传学，

假病毒，报告基因