质粒DNA的抽提、纯化与检测.ppt

*****琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

1.DNA的分子大小:

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2.琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3.DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

4.电源电压

在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

5.嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。

6.离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。YL-*分子生物学实验（综合性）质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定常规PCR技术感受态细胞的制备及重组质粒的转化真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测YL-*质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定实验DCBA实验安排上午：质粒DNA的提取与纯化中午：质粒DNAE的酶切F下午：电泳鉴定质粒质粒(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合环状双链DNA。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因。是重组DNA技术中重要的载体。质粒质粒的特性：相对独立性独立的复制单位赋予宿主细胞一些表型与宿主菌染色体DNA不同作为载体的质粒：多克隆位点选择标记容纳较大的外源DNA提取质粒DNA的目的与意义基因载体/基因克隆/基因工程：在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。如何获得批量的纯化质粒DNA分子？PARTONE（一）载体的制备：质粒DNA的提取与纯化提取方法概述基本步骤培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离、纯化质粒常用方法碱裂解法煮沸裂解试剂盒法氯化铯密度梯度离心法碱裂解法分离纯化质粒DNA基本原理：利用质粒DNA与染色质DNA变性与复性的差异。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性；当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。原理示意图溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖,（pH8.0）10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HCl溶液Ⅱ：0.2mmol/LNaOH,1%SDS溶液Ⅲ：pH4.8,[K+]=3mol/L,（pH4.8）[Ac-]=5mol/L重悬细菌；保护和缓冲作用裂解细菌蛋白、DNA变性中和NaOH质粒DNA复性染色质DNA、蛋白不能复性重要试剂碱裂解法提