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利用流式细胞仪筛选紫外诱变高含油小球藻

一、1.研究背景与意义

(1)高含油小球藻作为一种新型的生物能源，具有广阔的应用前景。随着全球能源需求的不断增长和环境保护意识的提高，开发可持续的生物能源已成为当务之急。小球藻作为一种富含油脂的微藻，通过光合作用能够高效地将太阳能转化为生物质能，因此研究高含油小球藻的筛选和培养技术对于推动生物能源产业的发展具有重要意义。

(2)紫外诱变技术作为一种有效的基因改良手段，已被广泛应用于微生物、植物和动物的遗传改良中。通过紫外照射，可以诱导小球藻基因发生突变，从而产生具有更高油脂含量的突变体。这种筛选方法具有操作简便、成本低廉等优点，为小球藻油脂产量提升提供了新的途径。本研究旨在利用紫外诱变技术筛选出高含油小球藻，为生物能源的开发利用提供新的资源。

(3)流式细胞仪作为一种先进的细胞分析技术，能够对大量细胞进行快速、准确的检测和分析。在生物能源领域，流式细胞仪的应用有助于对小球藻的生理状态、油脂含量等指标进行实时监测，从而实现对高含油小球藻的快速筛选。本研究将结合紫外诱变和流式细胞仪技术，对小球藻进行筛选和鉴定，以期获得高油脂含量的小球藻新品种，为生物能源产业的可持续发展提供技术支持。

二、2.材料与方法

(1)实验材料选用市售的小球藻（Chlorellaspp.）种苗，经过预处理后，以2%的接种量接种于装有100mLM9培养基的三角瓶中。培养条件为光照强度为150μmol·m?2·s?1，温度为25°C，光照周期为12小时。培养过程中，定期检测小球藻的生长状态，通过测定细胞密度和油脂含量来评估其生长和油脂积累情况。实验前，对小球藻进行3次重复培养，确保实验数据的可靠性。

(2)紫外诱变实验采用波长为254nm的紫外光源，以0.5mW·cm?2的照射强度对小球藻进行照射。照射时间为10分钟，照射前后分别测定小球藻的细胞密度和油脂含量。诱变处理后，将小球藻接种于新的M9培养基中，继续培养7天，以观察突变效果。筛选过程中，采用0.8%的琼脂糖平板进行平板划线，以1%的甘油作为碳源，观察突变体在平板上的生长情况。通过比较突变体与野生型小球藻的生长速度和油脂含量，筛选出具有较高油脂含量的突变体。

(3)流式细胞仪筛选实验采用BeckmanCoulterFC500流式细胞仪，对突变体进行细胞形态、细胞大小、细胞核DNA含量等参数的检测。实验前，将小球藻进行离心处理，收集细胞悬液。实验过程中，设置不同浓度的乙醇溶液对细胞进行固定，以减少细胞膜对荧光染料的干扰。通过流式细胞仪检测，筛选出具有较高油脂含量的突变体。实验数据采用SPSS22.0软件进行统计分析，以P0.05为差异显著水平。实验结果表明，流式细胞仪筛选出的突变体油脂含量比野生型小球藻提高了20%，具有较好的应用前景。

三、3.流式细胞仪筛选流程

(1)首先，将经过紫外诱变处理的小球藻进行预培养，确保其生长状态良好。将预培养的小球藻用无菌水清洗，然后使用细胞计数仪测定细胞密度，以确保筛选过程中的细胞数量适中。

(2)接下来，使用流式细胞仪进行细胞检测。将清洗后的小球藻制成细胞悬液，调整细胞浓度至适合流式细胞仪检测的水平。在检测过程中，设置适当的参数，包括前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）和荧光强度等，以区分不同细胞群体。

(3)根据流式细胞仪检测到的细胞参数，如细胞大小、细胞核DNA含量等，筛选出油脂含量较高的小球藻细胞群体。随后，将筛选出的细胞进行后续的油脂含量测定，以验证筛选结果的准确性。最后，将高含油小球藻进行扩大培养，为后续的油脂提取和生物能源利用做准备。

四、4.数据分析与结果讨论

(1)通过紫外诱变和流式细胞仪筛选，我们获得了多个具有不同油脂含量的突变体。对筛选出的突变体进行油脂含量测定，结果显示，突变体的油脂含量平均比野生型小球藻提高了15%。其中，一个突变体（命名为CM-1）的油脂含量最高，达到20.5%，显著高于野生型（10.2%）。这一结果与先前的研究报道相符，表明紫外诱变是一种有效的提高小球藻油脂含量的方法。

(2)在流式细胞仪检测中，CM-1突变体在FSC和SSC参数上呈现出与野生型不同的分布特征，表明其细胞形态和大小有所改变。进一步分析CM-1突变体的细胞核DNA含量，发现其DNA含量比野生型高出10%，这可能与其油脂积累能力增强有关。此外，通过PCR分析，我们发现CM-1突变体中存在与油脂代谢相关的基因突变，这进一步验证了其油脂含量提高的原因。

(3)为了验证CM-1突变体油脂提取的可行性，我们对CM-1进行油脂提取实验。结果显示，CM-1突变体的油脂提取率为35%，高于野生型的25%。进一步通过高效液相色谱（HPLC）分析，CM-1突变体的主要脂肪酸成分与野生型相似