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植物内生真菌分离培养的研究方法

一、1.材料与方法

(1)实验材料：本研究选取了多种植物作为内生真菌的潜在宿主，包括豆科、禾本科、菊科等不同科属的植物。植物样品采集于我国不同地区的自然环境中，以确保样品的多样性和代表性。具体采集地点包括东北地区的黑土地带、西南地区的山地森林以及东南沿海的湿地等。采集的植物种类包括大豆、小麦、菊花、水稻等，共计30种。样品采集后，立即使用无菌剪刀剪取健康部位，放入无菌塑料袋中，并迅速冷藏保存，以减少样品在运输过程中的污染。

(2)实验方法：本研究采用传统的分离纯化方法结合现代分子生物学技术对内生真菌进行分离和鉴定。首先，将采集的植物样品进行表面消毒，采用70%乙醇和5%次氯酸钠溶液交替消毒，消毒时间分别为30秒和2分钟。消毒后，用无菌水冲洗样品，去除消毒剂，然后将其置于无菌条件下进行组织分离。分离过程中，采用组织块接种法，将植物组织块接种于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上，在25℃恒温培养箱中培养。培养7天后，对长出的菌落进行初步观察和记录，包括菌落形态、颜色、边缘特征等。

(3)数据统计与分析：实验过程中，对分离得到的内生真菌进行形态学观察和分子生物学鉴定。形态学观察主要包括菌落直径、颜色、质地、边缘等特征。分子生物学鉴定采用ITS（InternalTranscribedSpacer）区域序列分析，提取真菌DNA后，通过PCR扩增ITS区域，并测序。测序结果与NCBI数据库中的已知真菌序列进行比对，根据相似度确定真菌种类。实验数据采用SPSS22.0软件进行统计分析，包括描述性统计、方差分析（ANOVA）和相关性分析等。此外，为评估不同植物内生真菌的多样性，采用香农-威纳指数（Shannon-Wienerindex）和辛普森指数（Simpsonindex）进行计算。

二、2.植物内生真菌的采集与样品处理

(1)采集地点与时间：植物内生真菌的采集工作在我国多个生态区域进行，包括东北地区的森林、西南地区的山地、东南沿海的湿地以及华北地区的农田等。采集时间选择在植物生长旺盛的季节，即春季和秋季，以确保样品的丰富性和代表性。在采集过程中，针对不同植物种类，分别选取了30种豆科、禾本科、菊科等植物作为研究对象。例如，在东北地区采集的大豆样品，采集量达到200份；在西南山地采集的菊花样品，采集量达到150份。

(2)样品采集方法：在采集过程中，采用随机抽样和重点抽样相结合的方法。随机抽样主要针对自然生长的植物，以获取具有代表性的样品；重点抽样则针对已知内生真菌种类较多的植物，如豆科植物大豆、玉米等。采集时，使用无菌剪刀或刀片剪取植物的健康部位，如叶片、茎、根等，确保样品的无菌性。采集后的样品立即放入无菌塑料袋中，并迅速放入冷藏箱中保存，以防止样品在运输和储存过程中受到污染。据统计，采集过程中，共采集到植物样品1000余份，其中有效样品800余份。

(3)样品处理与保存：采集到的植物样品在实验室进行表面消毒处理，以去除样品表面的细菌和真菌。具体操作为：将样品浸泡在70%乙醇溶液中30秒，然后用无菌水冲洗3次，以去除乙醇残留。接着，将样品浸泡在5%次氯酸钠溶液中2分钟，再次用无菌水冲洗3次，以去除次氯酸钠残留。消毒后的样品用无菌剪刀剪成小块，接种于PDA培养基上。在接种过程中，严格控制无菌操作，以防止污染。接种后的培养皿在25℃恒温培养箱中培养7天，观察内生真菌的生长情况。同时，将采集到的样品进行编号，记录采集地点、植物种类、样品数量等信息，以便后续数据分析和研究。据统计，经过处理和保存，有效样品率达到80%以上，为后续研究提供了可靠的数据支持。

三、3.内生真菌的分离纯化

(1)分离纯化过程：内生真菌的分离纯化过程主要分为样品的表面消毒、组织分离、菌落挑取和纯化培养等步骤。首先，对采集的植物样品进行表面消毒，使用70%乙醇和5%次氯酸钠溶液交替消毒，消毒时间为30秒和2分钟。消毒后，用无菌水冲洗样品，去除消毒剂。接着，采用组织块接种法，将植物组织块接种于PDA培养基上，接种点间距为1厘米，以确保分离纯化效果。培养条件为25℃恒温、光照12小时/天。

(2)菌落挑取与纯化：培养7天后，对长出的菌落进行初步观察，记录菌落的形态特征，如菌落大小、颜色、质地、边缘等。选取具有明显特征、生长良好的菌落进行挑取，使用无菌接种针从菌落边缘挑取一小块菌丝，接种于新的PDA培养基上，进行二次纯化。重复此过程，直至获得纯化后的内生真菌菌株。据统计，每次挑取纯化过程中，平均可获得20个以上的纯化菌株。

(3)菌株保存：纯化后的内生真菌菌株需进行保存，以备后续研究。保存方法主要包括斜面保存和冷冻保存。斜面保存是将纯化后的菌株接种于斜面PDA培养基上，放入4℃冰箱中保存。冷冻保存则是将菌株