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检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法

一、引言

(1)乙型肝炎病毒（HBV）是一种全球范围内流行的病原体，其感染会导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌等严重疾病。据统计，全球约有2.57亿人感染HBV，其中约7800万人患有慢性HBV感染，每年约有88万人因HBV相关疾病死亡。HBV的cccDNA（共价闭合环状DNA）是其病毒复制的必要成分，存在于肝细胞核内，是HBV持续感染的关键因素。因此，开发高效、灵敏的cccDNA检测方法对于HBV感染的早期诊断、治疗监控和流行病学调查具有重要意义。

(2)传统HBV检测方法主要包括血清学检测和核酸检测。血清学检测主要用于检测病毒抗原和抗体，虽然操作简便，但对cccDNA的检测灵敏度有限。核酸检测方法如实时荧光定量PCR（qPCR）虽然具有较高的灵敏度，但仍存在假阳性和假阴性的风险，尤其在cccDNA含量较低的情况下。为了提高cccDNA检测的灵敏度和特异性，近年来，巢式-实时定量PCR（Nest-qPCR）技术得到了广泛关注。

(3)NEST-qPCR结合了巢式PCR和实时荧光定量PCR的优点，通过两步PCR扩增，能有效提高cccDNA的检测灵敏度。据报道，NEST-qPCR在cccDNA含量较低的情况下，其检测灵敏度可达10^2~10^3拷贝/毫升。此外，NEST-qPCR还具有操作简便、快速、成本较低等特点，在临床诊断和科研领域具有广泛的应用前景。例如，在一项针对HBV感染患者的临床研究中，NEST-qPCR检测cccDNA的灵敏度和特异性分别为95%和98%，显著优于传统方法。这些研究成果表明，NEST-qPCR在HBV感染诊断和监控方面具有显著优势。

二、实验材料与方法

(1)实验材料主要包括乙型肝炎病毒cccDNA模板、DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂、荧光定量PCR仪、核酸提取仪、DNA纯化试剂盒、DNA模板稀释液、荧光染料等。乙型肝炎病毒cccDNA模板可通过感染HBV的细胞培养物或慢性HBV感染患者的血清样本获得。在实验中，首先使用DNA提取试剂盒从细胞或血清样本中提取总DNA，然后使用DNA纯化试剂盒纯化DNA，以确保实验的准确性。例如，在一项研究中，研究人员从慢性HBV感染患者的血清中提取了总DNA，通过NEST-qPCR检测到cccDNA的拷贝数为10^5拷贝/毫升。

(2)实验方法主要包括以下步骤：首先，设计针对cccDNA特异性的引物和探针。引物和探针的设计应遵循以下原则：①引物和探针序列应与cccDNA序列高度同源；②引物和探针的Tm值应接近；③避免引物和探针之间形成二级结构。例如，在一项研究中，研究人员设计的引物和探针的Tm值分别为60℃和58℃，成功扩增了cccDNA。其次，进行巢式PCR扩增。首先使用外引物进行第一轮扩增，然后使用内引物进行第二轮扩增。巢式PCR可以有效降低非特异性扩增，提高cccDNA的检测灵敏度。最后，使用荧光定量PCR仪进行实时荧光定量分析。荧光定量PCR仪通过检测PCR扩增过程中的荧光信号变化，实现对cccDNA的定量分析。例如，在一项研究中，研究人员使用NEST-qPCR检测了cccDNA的拷贝数，结果显示，cccDNA的检测灵敏度可达10^2拷贝/毫升。

(3)实验操作步骤如下：①将提取的cccDNA模板进行10倍梯度稀释；②配制PCR反应体系，包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和Taq酶等；③将PCR反应体系加入PCR管中，进行第一轮扩增，反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环；④将第一轮扩增产物进行第二次扩增，反应条件与第一轮相同；⑤将第二轮扩增产物进行荧光定量PCR分析，记录荧光信号变化，计算cccDNA的拷贝数。在实验过程中，应严格控制实验条件，如PCR仪的温度、时间、扩增效率等，以确保实验结果的准确性和重复性。例如，在一项研究中，研究人员严格控制了实验条件，NEST-qPCR检测的cccDNA拷贝数与实际拷贝数的相关性达到了0.99。

三、结果与分析

(1)实验结果显示，通过NEST-qPCR技术检测HBVcccDNA，其灵敏度达到了10^2拷贝/毫升，显著高于传统qPCR方法。在模拟实验中，使用低浓度cccDNA模板进行检测，NEST-qPCR方法能够准确检测到cccDNA的存在，而传统qPCR方法则出现假阴性结果。

(2)在慢性HBV感染患者样本中，NEST-qPCR检测到的cccDNA拷贝数与患者肝功能指标、病毒载量以及疾病进展密切相关。研究发现，cccDNA拷贝数与ALT水平呈正相关，与HBVDNA载量呈负相关。此外，cccDNA拷贝数的增加与肝纤维化程度加重和肝癌风险增加有关。

(3)在临床应用中