苹果树腐烂病抗病性鉴定技术规程.docxVIP

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DB14/T1128—2015

苹果树腐烂病抗病性鉴定技术规程

1范围

本标准规定了苹果树腐烂病抗病性鉴定的术语和定义、接种体制备、室内抗病性鉴定及调查方抗病性评价。

本标准适用于苹果树各个品种及砧木对苹果树腐烂病的室内抗性鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T1318农作物种质资源鉴定技术规程苹果

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

抗病性

植物体所具有的能够减轻或克服病原物致病作用的可遗传的性状。3.2

人工接种

在适宜条件下，人工操作将接种体放于植物体感病部位并使之发病的过程。3.3

抗病性评价

根据采用的技术标准判别植物寄主对特定病虫害反应程度和抵抗水平的描述。3.4

接种体

用于接种以引起侵染的任何病原物部分，真菌的接种体可以是孢子、菌核或菌丝。3.5

潜育期

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病原物侵染寄主后建立寄生关系开始，到出现明显症状为止的这一时期。3.6

病情指数

将普遍率和病害严重度相结合，用一个数值全面反映植株群体发病程度，具体按公式（1）计算。

DI=×100.......................................................................(1)

式中：

DI——病情指数；

NI——各级发病枝条数；

I——相对应的严重度级数值；M——调查总枝条数。

4接种体制备

4.1病原菌分离纯化、保存及扩繁

4.1.1培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。将马铃薯去皮、切成小块，用蒸馏水煮沸30min，纱布过滤，滤液定容至1000mL，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压灭菌20min。

水琼脂培养基：琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。4.1.2主要仪器及设备

光学显微镜、恒温培养箱、凝胶成像系统、超净工作台。

4.1.3病原菌分离方法

从病斑边缘病健交界处剪取0.5cm×0.5cm大小的病组织，用75%乙醇消毒90s，然后用无菌水冲洗3次，用灭菌滤纸将水吸干，置于PDA培养基上，28℃恒温培养箱中培养。

4.1.4病原菌纯化

4.1.4.1病原物培养

病菌分离物培养4d以后，从菌落边缘挑取少量菌丝接种至PDA培养基上，28℃恒温培养10～15d。

4.1.4.2制备孢子悬浮液

菌落表面形成分生孢子器后，用解剖刀将分生孢子器破碎后转移至含有1mL无菌水的1.5mL离心管中，充分混匀后用2层擦镜纸过滤，用一个新的1.5mL离心管收集滤液，使用血球计数板统计孢子浓度，用无菌水配成每mL含1×104个孢子的悬浮液，吸取100μL孢子悬浮液均匀涂布于2%的水琼脂培养基上，在超净工作台中吹干。

4.1.4.3培养单孢子菌落

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28℃条件下培养至分生孢子萌发，在10倍光学显微镜下镜检，挑取萌发的单个分生孢子置于新的PDA培养基上，28℃恒温培养，并保存备用。如果分离菌未产生分生孢子，则在水琼脂培养基上培养1d时，挑取单菌丝。

4.1.5病原菌保存

制作1.5mLPDAEppendorf离心管斜面，将待保存菌株接种至斜面，28℃恒温培养待菌丝长满斜面时，将Eppendorf离心管放置4℃保存。

4.1.6病原菌菌种鉴定

苹果树腐烂病菌鉴定方法参见附录A。

4.1.7接种体扩繁

依据抗病性鉴定目的，选取菌种，在接种前繁殖供试菌株，将保存的菌种接于90mm培养皿中PDA培基，28℃温箱中培养3d，在菌落离培养皿边缘10mm处用5mm灭菌打孔器打菌饼备用。

5室内抗病性鉴定

5.1鉴定设计

鉴定材料随机排列，每个鉴定材料3次重复，每个重复设10个枝条。

5.2鉴定材料

采集苹果树背上枝1~2年生枝条，按照NY/T1318执行。去掉叶片、长度为90cm~100cm作为接种材料。

5.3接种方法

5.3.1烫伤口

选取采集好的苹果枝条，用自来水冲洗2次，75%酒精冲洗1次，无菌水冲洗1次。将冲洗好的枝条放置于消毒的托盘中，用直径5mm的钉帽在枝条上烫伤口，伤口相距10cm。每个枝条烫5个伤口，4个接菌，1个做对照。

5.3.2接种

取4.1.7中制备的菌饼接种于枝条烫伤部位，接种体上方2cm处包裹用无菌水