原生质体融合.ppt

以矮牵牛为例：白化苗原生质体1白化苗原生质体2杂种细胞融合限定培养基绿色愈伤组织或幼苗杂种A、白化互补选择法营养缺陷型互补选择01Gly-型细胞02Pro-型细胞03融合04Gly-、Pro-培养基05杂种细胞06培养07抗B不抗A型细胞02含A、B培养基04杂种细胞05抗A不抗B型细胞01融合03C、抗性互补选择温度敏感型选择耐高温不耐低温型细胞耐低温不耐高温型细胞融合高温下培养低温下培养杂种细胞01机械选择法：利用天然存在或是人为造成的两个亲本在物理特性上的差异即可见标记，进行筛选。利用或人为的造成细胞生长或分化能力上的差异进行筛选。做法：在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行培养的方法。0203双荧光标记选择法：使用两种不同的荧光染料给双亲原生质体染上不同的颜色，然后借助不同的荧光标记，在显微镜下进行筛选。荧光显微镜FITC标记红色荧光无叶绿体的原生质体含叶绿体的原生质体苹果绿荧光杂种细胞56%Option223%Option130%Option3异硫氰酸荧光素（FITC）异硫氰酸罗丹明（RITC）（三）杂种植株的再生和鉴定植物原生质体融合及再生植株过程杂种植物形态特征、特性鉴定同工酶分析分子标记鉴定：RFLP、AFLP、SSR、ISSR、RAPD标记鉴定杂种植物的核型分析杂种植株的鉴定方法：百子莲属植物70年代，技术建立和完善优化1972年获得烟草种间体细胞杂种1975年高Ca高pH、加PEG融合方法、电融合法大量成功报道，不少为异想天开的实验80年代初，由模式植物转向农作物/经济作物，对称融合到非对称融合，创造新种质的技术手段80年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道90年代至今，成为一种育种手段绞股蓝丝瓜烟草的细胞融合五、原生质体的遗传饰变体细胞杂交研究历程及一般概念体细胞杂交的一般流程杂交细胞的鉴定123细胞杂交的应用4原生质体融合的意义02（一）体细胞杂交的含义及研究历程概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。使植物无性杂交成为可能使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实打破了物种间的界限01植物体细胞杂交的几个重要进展1960年Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971年Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；1974年Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋马铃薯）；1981年Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。（二）植物细胞融合的程序：◆原生质体分离的分离、纯化◆融合方法选择◆杂种细胞的筛选◆愈伤组织形成、分化植株再生◆杂种植物的鉴定原生质体融合的方法电脉冲仙台病毒(Sendaivirus)飞秒激光诱导融合电融合空间细胞融合化学方法高pH-高浓度Ga2+物理方法聚乙二醇PEG）生物方法NaNO3处理（1）电融合法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。◆电融合特点：效率高对原生质体伤害性小对融合细胞数易于控制方法：微电极法和双向电泳法双向电泳法：通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。电融合仪Fusionphasesofoat（燕麦）protoplasts(Avenasativa)微电极法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；完整烟草原生质体（40×）原生质体成串（40×）微电极法：再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。融合过程：04030102原生质体在诱融剂