动物细胞的微囊化培养.ppt

制备方法的难易和成本由于固定化基质类型比较复杂，因此各种固定化方法的成本很难比较。海藻酸盐和琼脂糖是以化学试剂形式出售；胶原珠是以无菌形式提供给使用者，以便于接种。固定化培养存在的问题固定化细胞培养的细胞密度较一般悬浮培养高10-100倍，但同时也带来了如何保证足够的营养物质和氧的传递问题。(2)细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题。包埋在凝胶或微囊中死亡的细胞会对其他细胞产生污染和毒害作用。(3)培养基及固定化基质价格昂贵，生产成本高居不下。尤其是高效的微载体细胞培养介质，销售价格一直呈上涨趋势。(4)目前对细胞代谢和生长动力学的研究以及在线监测水平还远不足以设计出确定的优化培养系统，从而导致昂贵培养基的浪费。固定化动物细胞培养的展望固定化动物细胞培养工程发展的总方向是大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。从国际上的发展趋势看，动物细胞培养技术主要有：（1）开发细胞培养反应器和培养系统；（2)开发培养贴壁细胞的载体；（3)开发微囊技术；（4)开发杂交、重组技术；（5)开发无血清和化学合成的培养基；（6)蛋白质浓缩和提纯技术。微囊化是固定化技术中的一种，是用一层亲水性的半透膜将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或动植物细胞包围在珠状的微囊里，从而使得酶等生物大分子和细胞不能从微囊里逸出，而小分子的物质、培养基的营养物质可以自由出入半透膜，达到催化或培养的目的。12第一节动物细胞的微囊化微囊化的神经组织细胞微囊化概述人工细胞的概念由加拿大马吉尔（McGill）大学教授于1957年首次提出并应用具有半渗透性薄膜的微胶囊固定活体细胞或组织取得成功。由于微胶囊膜起到了类似细胞膜的作用,且固定后体系的形态和功能酷似活性细胞,所以称之为“人工细胞”。微囊化细胞的模式图年代初,Lim等人将微囊化技术与组织细胞移植相结合,制备了具有良好生物相容性的海藻酸钠/聚赖氨酸(APA)微胶囊作为免疫隔离工具,包埋猪胰岛细胞形成人工细胞,并移植入糖尿病大鼠体内,结果表明该人工细胞成功地调节了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被称为人工胰腺.这一研究成果较好地解决了组织细胞移植过程的免疫排斥问题,避免或减少了昂贵的免疫抑制剂的使用,为组织细胞移植治疗神经/内分泌系统疾病提供了新思路.01膜应具有足够的机械强度以抵抗培养过程中的搅拌，不至于使微囊破裂微囊化的过程要温和，快速，不损伤细胞，尽可能在液体状态和生理条件下制备。微囊化所用的试剂和膜材料必须对细胞无毒害作用。微囊化所形成的膜必须能够使营养物和代谢产物自由通过，膜的孔径可以控制。020304需满足条件：二、动物细胞微囊化方法聚赖氨酸/海藻酸(PLL/ALG)微囊化原理海藻酸是以1，4键连接的聚醛酸，其主要成分是甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。当它的水溶液以钙盐的形式存在时，则成凝胶状态。用螯合剂将钙离子去除后，海藻酸又回复到溶液状态。海藻酸钙凝胶用聚赖氨酸处理后，其接触部分不再被螯合剂去钙而溶解动物细胞与海藻酸溶液混合，经过微囊化发生器滴入CaCl2溶液中，形成凝胶微珠，然后用聚赖氨酸溶液处理微球表面，最后再用柠檬酸去除微珠的钙离子，这样，微珠内部的海藻酸成液态，动物细胞悬浮其中，而微珠表面由于受到聚赖氨酸的处理而不再溶解，形成一层薄膜，动物细胞就被这层膜包在微囊里了，形成细胞微囊。（2）微囊化装置及步骤制备微囊化动物细胞要经过以下几步（海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸微囊）制备微囊化动物细胞要经过以下几步（海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸微囊）1、无菌收集动物细胞，离心后再生理盐水洗涤。2、离心收集细胞，并加入海藻酸溶液混合均匀，使成悬浮液。3、将悬浮液装入微囊发生器中制成微滴。4、微滴加到CaCl2溶液中形成微胶珠。5、凝胶珠用生理盐水洗去残留的CaCl2.6、凝胶珠悬浮于聚赖氨酸溶液中，使之形成膜。7、凝胶珠再用CaCl2溶液洗，用CHES缓冲液固化。8、凝胶珠用生理盐水洗涤以后，再用ALG溶液处理。9、生理盐水洗涤后的凝胶珠加0.05mg/l柠檬酸溶液处理，使半透膜内的ALG成液态，然后用生理盐水冲洗。01微囊半透明孔径影响因素02微囊的质量影响因素03细胞的活性影响因素(3)影响微囊化的一些因素微囊半透膜的孔径是培养基营养成分、代谢物进行膜内外交换、截留一定分子量蛋白在囊内的关键，如何选择是一重要问题。微囊的膜是多阴离子的海藻酸与多阳离子的聚赖氨酸相互作用而形成的。研究表明，此半透膜的孔径主要由聚赖氨酸的分子量决定，一般来说用高分子量的聚赖