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第九章工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种原生质体育种微生物原生质体融合育种细菌原生质体融合育种放线菌原生质体融合育种酵母菌原生质体融合育种霉菌原生质体融合育种第一节原生质体育种原生质体具有的新特性：对诱变剂敏感对噬菌体不敏感不受感受态影响什么是原生质体？包括：原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原生质体育种。一、微生物原生质体再生育种1．原生质体再生育种的一般程序：出发菌株的选择→菌种活化和预培养→原生质体制备→原生质体再生→高产菌株分离（初筛）→复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特性研究。2．原生质体再生育种实例小单孢菌福堤霉素微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正突变株。敏感，细胞壁的重建和分裂能力的再生，对数期细胞，不需要遗传标记二、微生物原生质体诱变育种（一）原生质体诱变育种方法1．物理诱变剂诱变原生质体的一般程序：取10ml对数生长期微生物培养物，离心收集菌体，无菌水洗涤→离心，菌体沉淀物用酶液悬浮，水解去壁制成原生质体→离心，高渗溶液洗涤原生质体→原生质体悬浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内→将培养皿移至紫外灯下诱变处理→置暗处后处理一定时间→移入再生培养基中再生培养（由于原生质体较脆弱，用双层平板法再生）→分离优质菌株→突变株稳定性试验→突变株鉴定。是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。化学诱变剂诱变原生质体的一般程序通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及再生→选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度→加入原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体）→诱变处理→离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤→稀释、分离到再生平板上（双层平板法）→再生培养→观察、筛选突变株→复筛→突变株鉴定。原生质体诱变周期一般比常规诱变育种要长，难度更大。010302扩展青霉原生质体制备原生质体再生突变株筛选原生质体诱变（二）原生质体诱变育种实例微生物原生质体转化育种整条DNA或DNA片段的转化01微生物原生质融合育种02其他微生物原生质体育种03用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优良性状于一体的稳定融合子。12聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱导融合又将融合率提高10倍。3聚乙二醇诱导和电融和第二节微生物原生质体融合育种杂交率高01受接合型或致育型的限制小02遗传物质传递更为完整03存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能04有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株05提高菌株产量的潜力较大06有助于建立工业微生物转化体系07原生质体融合育种的特点原生质体融合育种五大步骤：1直接亲本及其遗传标记选择；2双亲本原生质体制备与再生；3亲本原生质体诱导融合；4融合重组体（称为融合子）分离；5遗传特性分析与测定；6二、原生质体制备与再生（一）原生质体制备最有效和最常用的是酶法。一、直接亲本及其遗传标记的选择一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为直接亲本直接亲本都带有遗传标记①超声波处理菌体释放原生质体

②酶解脱壁释放原生质体

处理细菌细胞壁用酶溶菌酶Lysozyme

处理放线菌细胞壁用酶LyticEnzyme裂解酶、

Lysozyme溶菌酶处理真菌用酶纤维素酶Cellulase

酵母裂解酶Zymolyaseβ1,3葡聚糖酶

几丁质酶Chitinase

商品酶

Novozyme234来自Trichodermaharzianum

Lywallzyme广东微生物研究所溶壁酶

Glucuronidase葡聚糖苷酸酶(foryeast)原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处理等因素有关。酶法分离原生质体的影响因素培养基组成菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌和酵母菌多用振荡沉没培养法。菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前期和对数期效果最好。酵母菌制