低压液相层析色谱技术.ppt

洗脱用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。使用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。六、流速及控制洗脱液流速也往往影响层析的分辨率在整个分离过程中，洗脱液通过柱时保持稳定的流速是十分重要的。与流速有关的因素所用介质的结构、粗细及数量；层析柱大小，介质填装的松紧;洗脱液的粘度、操作压等.必须根据具体条件反复试验以确定一个合适的流速。太高的流速使洗脱峰加宽，继而降低了分辨率；过高时，有时会使流速先快后慢甚至发生阻塞。流速可以通过调节“操作压”来控制，“操作压”相当于在柱上部的贮液瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差。第五章低压液相层析（色谱）技术慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。0102经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀高压下输送流动相柱效较高分析周期短常压下输送流动相柱效较低分析周期长现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀特性经典LCHPLCHPLC优势进样人工加样进样器准确溶液流动重力高压泵快速分离,重现性好检测和定量收集馏分检测连续检测高灵敏度,自动化实验结果棒式图色谱图五高一广表11.1两种不同形式液相色谱的这样特征国产低压液相色谱系统国产常压液相色谱系统的组成层析柱恒流泵核酸蛋白检测仪自动分部收集器记录仪低压液相色谱系统层析柱（a）自制简易层祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子）层析柱：填料的充填恒流泵：提供稳定的液流紫外检测仪：信号检测部分收集器：样品的分部收集记录仪：记录信号反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16．换向开关（逆、顺）；17．手动开关BS－100自动部分收集器安装圈层析系统连接示意图密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6.自动收集器；7.核酸一蛋白质检测仪AKTAprimeAKTAexplorerAKTAFPLC二、柱层析法的一般技术层析柱层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如:凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。凝胶的前处理的方法溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。02010304在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。装柱01装柱是最关键的一步。02重力沉降法装柱03陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。04柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l～3cm柱高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。05层析柱的形状，一般直径与高度的比为l：15为宜。柱形必须根据层析介质和分离目的而定。待分离物质的性质相近，柱越细长，则分离效果越好，但流速较慢。在样品组分并不复杂的情况下，采用“矮胖柱”。三、平衡层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于3-5倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。检查柱是否均匀，可用蓝色葡聚糖2000，在恒压下走柱，如色带均匀下降，说明柱是均匀的，可以使用，否则应重新装柱四、加样量和加样体积01加样量的多少和加样体积大小是影响分离效果的关键因素，加样量越少和加样体积越小，则分离效果越好。03对于分析性柱层析，加