061016生物大分子的分离和纯化.ppt

提要生物大分子是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。DNA、RNA和蛋白质是生物体中最重要的生物大分子，是分子生物学研究和分子诊断的对象。它们的分离纯化是分子生物学研究和疾病分子诊断的基础，而蛋白质的分离纯化也具有生产的应用。核酸和蛋白质的结构与功能及相互作用是分子水平生命活动的基础；内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根因。核酸分离纯化的原则是：一保持核酸一级结构的完整性；二是尽可能提高核酸制品的纯度。本章内容第一节核酸分离纯化的设计及原则第二节真核细胞基因组DNA的分离纯化第三节真核细胞总RNA的分离纯化第四节质粒DNA的提取与纯化第五节蛋白质的分离与纯化第一节

核酸分离纯化的设计

及原则

一、材料与方法的选择（一）材料与方法的选择核酸存在于动植物的细胞以及各种微生物之中。常见的标本包括血液、尿液、唾液、组织及培养的细胞。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求，另外尚需考虑制备核酸所需的时间与成本（二）选择原则一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。（三）保持核酸的完整性在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。二、技术路线的设计（一）核酸的释放一般情况下，DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外）。因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。破碎细胞的方法很多包括机械和非机械法两大类。对于富集在细胞特定区域的核酸，一般应先收集该部分核酸，可获得高纯度、高浓度且结构较完整的核酸分子。（二）核酸的分离与纯化应该清除的杂质主要包括三部分：非核酸的大分子污染物、非需要的核酸分子及在分离纯化过程中前后加入的对后继研究与诊断有影响的溶液和试剂。随着提取试剂的逐步加入，加上去除杂质过程中核酸分子不可避免地丢失，样品中核酸的浓度无疑会逐步下降，当不能满足后续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易将核酸溶液调至所需浓度。此外，还能清除部分杂质和某些盐离子。因此，常在加入一定浓度的盐后，用有机溶剂沉淀抽提液中的核酸。常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁；常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%－75%的乙醇洗涤去除。三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定核酸浓度的测定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。⑴紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。⑵荧光光度法：核酸的荧光染料EB嵌入碱基平面后，核酸在UV激发下发出红色荧光⒉纯度鉴定⑴紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。⒊完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值。电泳结果电泳结果可检测RNA的完整性，28S和18S真核细胞的比值约为2：1，表明无RNA降解，由下至上分别为5S、18S和28S的RNA。（二）核酸的保存

DNA的储存DNA溶于TE缓冲液中在-70℃冰箱可保存数年。当TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少。加入少量氯仿，可避免细菌对核酸的污染。RNA的储存RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，在-70℃保存。如用DEPC处理水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin，保存时间更可长。注意冻融产生的剪切力。第二节

质粒DNA的提取与纯化质粒基本知识定义：质粒（plasmid）是核外基因，双链、共价闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。特点：自主复制稳定遗传质粒不相容性赋予宿主性状。载体（vector）：体外重组DNA实验中，将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。质粒DNA提取3个步骤培养细菌对数生长晚期。收集和裂解细菌离心DNA质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。纯化质粒离子交换层析、凝胶过滤层析、分