核酸的分离纯化.pptVIP

核酸的别离纯化

;主要内容;Question?;核酸是遗传信息的携带者，遗传和突变的物质根底。

核酸的组成：五碳糖、磷酸、碱基

核酸包括DNA和RNA，它们的区别在于核糖；T/U。

DNA双螺旋结构，tRNA三叶草结构

碱基互补配对原那么

中心法那么

Gene，genome，ORF，exon，intron;内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、开展的根源。

核酸是临床检验的第四类重要的生物大分子。

核酸多与蛋白质结合成核蛋白〔nucleoprotein〕。

DNA、RNA的别离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最根底工作。;物理性质;核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pH值而改变。;核酸别离纯化选择原那么;1意义：为什么？

2如何保持结构完整性？

1〕温度不要过高；

2〕控制一定的pH值范围(pH值5-9)；

3〕保持一定的离子强度；

4〕减少物理因素对核酸降解的机械剪切力〔剧烈的物理震荡、反复冻融〕。;5〕防止核酸的生物降解;1DNA酶(DNase)抑制剂;2RNA酶〔RNase)抑制剂;(1)DEPC(焦碳酸二乙酯)

(diethylpyrocarbonate)

粘性液体，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

作用机制：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环〔蛋白质中His〕结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性

使用注意：1〕DEPC也能破坏单链核酸中大局部腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。2〕容易降解，保存在4℃或液氮中；3〕提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿,37℃2h以上。4〕实验用试剂〔Tris,DTT例外〕应用终浓度0.1%的DEPC水制备，37℃水浴过夜，高压灭菌去除残存DEPC。5〕对眼睛和气道粘膜有强刺激，防止吸入，是潜在的致癌物质。;〔2)肝素

〔3〕复合硅酸盐〔Macaloid)

〔4〕RNase阻抑蛋白〔RNasin〕

〔5〕氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-

RibonucleosideComplex,VRC)

(6)异硫氰酸胍;〔二〕保证纯度〔Purity〕;操作步骤：;〔二〕核蛋白的解聚、变性蛋白质的去除

核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电作用力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。

别离核酸最关键的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时防止核酸降解。;常用方法：

1参加浓盐溶液〔如NaCl〕

核酸-蛋白质参加NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；

2参加SDS

SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使蛋白质变性让核酸从蛋白质上游离出来的功能；;3酚/氯仿抽提

酚：能使蛋白质变性溶解，同时抑制DNase的降解作用

氯仿：加速有机相与水相分层，去除核酸溶液中剩余的酚，因为剩余的酚会影响后续的酶反响。

异戊醇：降低外表张力，减少气泡产生，使离心后的水相、变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。

〔酚：氯仿：异戊醇=25：24：1〕;1〕使用注意

酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，说明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。

2〕平安操作

酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。;〔三〕核酸的浓缩、沉淀和洗涤;1用于核酸沉淀的盐类及浓度;2有机沉淀剂;〔2〕异丙醇1:1;3核酸沉淀的温度和时间;DNA乙醇沉淀举例;(四〕核酸的浓度、纯度及完整性测定;各种碱基的紫外吸收光谱;操作步骤;举例说明DNA量计算方法：

DNA样品体积=100μl

1/10稀释：20μlofDNA样品+180μl去离子水

用0.2ml比色皿检测A260=0.2

样品DNA浓度=50μg/mlxA260x稀释倍数

=50μg/mlx0.2x10

=100μg/ml

=100μg/1000μl

=0.1μg/μl

DNA总量=浓度x体积

=100μg/mlx0.1ml

=10μgofDNA;纯DNA样品OD260/OD280应为1.8

OD260/OD230应大于2.0

1)OD260/OD280大于1.9时，说明有RNA污染。

2)小于1.6时，说明样品中存在蛋白质或酚污染；

3)OD260/OD230小于2.0