《分子荧光分析》课件.pptVIP

分子荧光分析

课程目标掌握分子荧光分析的基本原理了解荧光现象、荧光光谱和荧光分析方法的原理熟悉分子荧光分析仪器的操作掌握荧光分光光度计的基本结构、工作原理和使用方法学习分子荧光分析的应用了解荧光分析在生物化学、药物分析、环境监测等领域的应用

内容大纲1荧光光谱及特征荧光现象的物理基础2荧光分光光度计的原理仪器组成和工作原理3分子荧光分析的基本方法定性和定量分析方法概述4荧光猝灭荧光强度降低的机制和影响因素

荧光光谱及特征荧光光谱是物质发射的荧光强度随波长变化的曲线，它反映了物质的荧光特性。荧光光谱的特征包括：激发光谱：是指在特定发射波长下，不同激发波长所对应的荧光强度。发射光谱：是指在特定激发波长下，不同发射波长所对应的荧光强度。荧光量子产率：是指物质吸收一个光子后发射荧光光子的数量与吸收光子数量之比。荧光寿命：是指物质处于激发态的平均时间。

荧光分光光度计的原理1激发光源提供特定波长的光线激发样品中的分子。2单色器选择特定波长的激发光和发射光。3样品池盛放待测样品，使激发光照射样品。4检测器检测样品发射的荧光信号，并转换为电信号。5信号处理将电信号放大和处理，得到荧光强度或光谱数据。

分子荧光分析的基本方法激发光谱法在固定发射波长下，改变激发波长，测定荧光强度随激发波长的变化关系。发射光谱法在固定激发波长下，改变发射波长，测定荧光强度随发射波长的变化关系。荧光寿命法测量荧光物质在激发光源关闭后，其荧光衰减的时间常数。荧光偏振法利用荧光偏振的变化来分析物质的结构和运动情况。

荧光猝灭荧光猝灭是指在特定条件下，荧光物质的荧光强度下降的现象。猝灭剂的存在会导致荧光物质的激发态寿命缩短，从而降低荧光强度。

荧光测定的干扰因素猝灭猝灭是指荧光物质的荧光强度降低的现象。猝灭剂的存在会减少荧光物质的激发态寿命或降低量子产率，从而导致荧光强度下降。内滤光内滤光是指溶液中某些物质对激发光或发射光的吸收，导致荧光强度下降。这通常发生在溶液中存在高浓度的吸收物质时。瑞利散射和拉曼散射瑞利散射和拉曼散射是光与物质相互作用产生的散射现象，它们会干扰荧光信号的测量。

内参法和外参法内参法利用样品中本身存在的物质作为内标物。外参法使用已知浓度的标准物质作为外标物。

内参标准的选择1稳定性内参标准应具有良好的稳定性，不受实验条件的影响，如温度、pH值、溶剂等。2特异性内参标准应具有良好的特异性，不会与待测物质发生交叉反应。3易获得性内参标准应易于获得，价格合理，方便使用。

标准曲线的绘制和使用1标准溶液准备选择合适的标准物质，并制备一系列不同浓度的标准溶液。2荧光强度测量在相同条件下，分别测量每种标准溶液的荧光强度。3绘制标准曲线以标准溶液的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。4未知样品测定测量未知样品的荧光强度，并根据标准曲线确定未知样品的浓度。

定量分析的步骤样品准备确保样品均匀，溶解于合适的溶剂中，以最大程度地减少荧光猝灭或增强。标准曲线制作使用一系列已知浓度的标准品，测量它们的荧光强度，绘制标准曲线，以建立荧光强度与浓度之间的关系。样品分析测量样品的荧光强度，并根据标准曲线确定样品的浓度。结果分析对结果进行分析，评估测量误差，并得出结论。

定性分析步骤1确认样品根据荧光光谱图和标准物质比对，确定样品中是否存在特定物质2荧光强度比较比较未知样品和标准物质的荧光强度，判断两者是否相同3荧光光谱特征观察荧光光谱的形状、峰位、峰宽等，判断样品的组成和结构

荧光探针选择性荧光探针可以特异性地识别和结合目标分子，例如蛋白质、DNA、RNA或离子。灵敏度荧光探针的灵敏度非常高，可以检测到低浓度的目标分子，从而提高分析的准确性。可视化荧光探针可以用于在显微镜下可视化目标分子，例如细胞内的结构或生物过程。

荧光标记技术标记原理将荧光染料与生物分子结合，通过荧光信号的检测，实现对特定物质的识别和定量分析。应用领域广泛应用于生物化学、细胞生物学、免疫学、药物分析等领域。优点灵敏度高、特异性强、操作简便，可用于多种生物体系的研究。

荧光染料的选择光谱特性荧光染料的选择取决于待测物质的光谱特性，例如激发波长和发射波长。生物相容性对于生物样品分析，需要选择对生物体无毒的荧光染料。化学稳定性荧光染料应在分析条件下稳定，不会发生降解或氧化。

样品前处理溶解选择合适的溶剂将样品溶解，确保样品在溶液中稳定存在。纯化去除可能干扰荧光测定的杂质，如蛋白质、脂类等。浓缩提高样品浓度，以获得更高的荧光信号。

溶剂对荧光的影响溶剂极性溶剂的极性会影响荧光分子的极性，进而影响其荧光强度。溶剂粘度高粘度溶剂会降低荧光分子的运动速度，从而降低其荧光强度。溶剂的性质一些溶剂会与荧光分子发生相互作用，例如形成氢键或络合物，从而影响其荧光特性。

pH对荧光的影响荧光强度变化荧光强度会随着pH值的