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限时练26突破基因工程类大题

(时间：40分钟分值：50分)

【综合提升】

1.(14分)(2024·厦门外国语学校调研)转录因子FOXO1与DNA结合可提高某些促凋亡基因的转录水平，促进神经元凋亡。让FOXO1基因发生定点突变，使其表达的蛋白第249位点的丝氨酸替换为天冬氨酸，用来模拟FOXO1被蛋白激酶Cdk5磷酸化后的状态。

(1)(8分)定点突变是利用PCR等方法，在引物中引入突变序列，从而实现目的基因的定向改造。以已有的质粒a0为模板(如图1，★代表突变位点)，将质粒a0定点突变成质粒a1。

①为了将突变序列准确地定位在目标序列上，引物部分序列应与FOXO1基因拟突变位点两端的序列________________。将FOXO1基因与GFP(绿色荧光蛋白)基因进行融合的目的是___________________________________________

________________________________________________________________。

②天冬氨酸的密码子为GAC，丝氨酸的密码子为UCU，正向引物★处的碱基序列为____________________________________________________________。

③至少经过________轮PCR，可以得到发生定点突变的质粒a1。

图2两组实验的扩增产物DNA电泳结果，M为DNA标准参照物，对照组不加模板

④探究引物组合1与引物组合2扩增目的基因的效果，根据图2的实验结果分析，哪对引物更适合作为定点突变的引物？____________(填“引物组合1”或“引物组合2”)，另一引物组合没有扩增产物的原因可能是

_______________________________________________________________。

(2)(2分)在过氧化物诱导下，Cdk5会磷酸化FOXO1249位点的丝氨酸，科研人员试图探究其在细胞内的分布是否会发生改变。将构建好的质粒a1转染进体外培养的原代神经元中，对照组的神经元需要转染质粒a0。一段时间后，发现对照组的绿色荧光主要集中在细胞核中，而实验组的绿色荧光滞留在细胞质中。推测FOXO1被Cdk5磷酸化后，对凋亡起到抑制作用的原理是

__________________________________________________________________

______________________________________________________。

(3)(4分)为了使课题研究更加完善，现有以下两种实验思路，请补充完整。

思路1：还可对比(2)中对照组与实验组的______________________________

__________________________________________________________________。

思路2：利用某种药物抑制____________________，检测受过氧化物诱导后的FOXO1在细胞中的分布情况。

2.(16分)(2024·江西九校联考)基因工程中的载体分为克隆载体和表达载体。克隆载体用来克隆和扩增DNA片段，而表达载体可使外源基因在宿主细胞中有效表达。胡萝卜抗冻蛋白基因(afp)是人类发现的第一个植物抗冻蛋白基因，对于植物抗冻基因工程具有非常重要的意义。如表为几种限制酶的识别序列及酶切位点，如图表示构建afp基因表达载体的过程，其中PUCm－T、PBI121为人工改造后的质粒，LacZ基因可用于重组质粒的筛选。

限制酶

识别序列

BamHⅠ

5′—G↓GATCC—3′

EcoRⅠ

5′—G↓AATTC—3′

PstⅠ

5′—C↓TGCAG—3′

XbaⅠ

5′—T↓CTAGA—3′

SmaⅠ

5′—CCC↓GGG—3′

(1)(4分)通过PCR可获得大量的afp基因，PCR的原理是________________________，扩增时需选用的引物为____________。

(2)(4分)PCR产物往往在引物端含有多个A聚合的尾，而PUCm－T尾端由多个T聚合，所以在构建克隆载体时不需要用限制酶处理afp和PUCm－T，理由是__________________________________________________________________

_________________________________________________________________。

(3)(4分)LacZ基因编码的β－半乳糖苷酶可催化乳糖水解，培养基中添加的物质IPTG可诱导LacZ基因的表达，将培养基中的白色物质X－gal转