小麦胚芽ACP的提取与纯化.ppt

小麦胚芽中酸性磷酸酶的分离纯化临床生物化学教研室酶分离纯化的过程选择原料组织及细胞破碎酶的抽提酶的纯化常用的酶分离纯化方法盐析法有机溶剂沉淀法离心法电泳法层析法吸附法透析法了解常用的酶分离纯化技术熟悉小麦胚芽中分离纯化ACP的操作过程掌握小麦胚芽中分离纯化ACP的原理CBA一、实验目的酸性磷酸酶(acidphosphatase，ACP)广泛分布于自然界中，存在植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。植物种子中的ACP在发芽时含量会猛增，随芽胚的生长ACP含量会下降。选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化ACP，具有来源方便、酶含量高等优点。二、实验原理ACP能溶解于水和稀缓冲液中；溶于35%饱和度的硫酸铵溶液中，在57%饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；pH小于6.5时稳定性增加，乙酸和枸橼酸可增加ACP溶液的稳定性；在中性及高温条件下不稳定，在70℃时相对稳定；Mn2+、Mg2+为ACP激活剂，而Cu2+、Pi、Hg2+、Zn2+、Ag+、Pb2+、NaF、草酸盐、酒石酸盐和甲醛等是ACP的抑制剂。二、实验原理1mol/LMnCl2溶液1饱和(NH4)2SO4溶液(pH5.5，4℃)按76.7g(NH4)2SO4，加蒸馏水溶解至100ml20.25mol/LEDTA钠盐溶液(pH5.7)3甲醇-30℃预冷4新鲜麦芽50g5三、实验试剂四、操作步骤1.小麦胚芽的准备选取饱满、新鲜的小麦粒，冷水洗涤，除去干瘪的麦粒及泥沙，再用冷水浸泡2～4d(天热时4h左右)使麦粒发胀。将发胀的麦粒平摊于沥水的覆盖有2层纱布的塑料筐中，上面覆盖双层湿的纱布，置于通风处，每天浇水2～3次，保持麦粒的湿度。一般情况下，发胀的麦粒在室温20℃情况下，经3～4d就可以发出胚芽。在此过程中应注意通风透气，否则麦粒会发霉。四、操作步骤小麦胚芽中ACP的初步提取称取新鲜小麦胚芽50g，加冷蒸馏水100ml，用捣碎器在高速、间断条件下冰浴捣碎3～5min，得到麦芽匀浆，将麦芽匀浆用2～4层纱布过滤，尽量将液体挤出，弃去纱布上固体物。四、操作步骤3.ACP的纯化本实验采用分级离心+分段盐析法+热变性+有机溶剂沉淀法：ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以此逐步离心分离；ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70oC仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。ACP分离纯化的步骤流程小麦胚芽50g+100ml冷蒸馏水滤液（固体物弃去）研碎，4层纱布过滤7000rpm，离心5min记录体积上清液I留3ml置于冰箱9000rpm，离心5min1mol/LMnCl22ml/100ml上清液I记录体积上清液II留3ml置于冰箱（激活并稳定ACP，沉淀杂蛋白）缓慢搅拌弃去沉淀弃去沉淀ACP分离纯化的步骤流程7000rpm，离心5min上清液7000rpm，离心5min饱和硫酸铵54ml/100ml上清液II，达35%饱和度上清液II（溶解ACP，沉淀杂蛋白）7000rpm，离心5min记录体积上清液III留3ml置于冰箱62oC水浴2min，迅速冷却至6~8℃冷水浴3min饱和硫酸铵51ml/100ml上清液，达57%饱和度沉淀（酶粗提物）（沉淀ACP）缓慢搅拌缓慢搅拌弃去沉淀弃去上清液弃去沉淀