基因工程一轮复习优秀课件.ppt

01020304目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定知识点二：基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取1、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的常用方法：（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成（一）从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库基因组文库部分基因文库（cDNA文库）提取某种生物的全部DNA01用适当的限制酶切02一定大小的DNA片段03将DNA片段与载体连接04导入受体菌中储存05基因组文库06基因文库的构建方法07直接分离法(鸟枪法)08（2）反转录法某种生物的单链mRNA01单链互补DNA02双链cDNA片段03导入受体菌中储存04与载体连接05cDNA文库06反（逆）转录酶07DNA聚合酶08基因组DNA文库cDNA文库2.基因组DNA文库与cDNA文库比较2.基因组文库和部分基因文库的比较小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。③前提条件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶模板DNA（二）利用PCR技术扩增目的基因④过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子——根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成已知核苷酸序列的较小基因可以化学合成，不需要模板。（三）人工合成获取目的基因人工合成DNA合成仪(基因序列已知，且比较小)质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种1.基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建——核心限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标记基因的完整性，以便于检测和表达。2.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,RNA聚合酶的结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞提醒：载体与表达载体的区别：与载体相比较,表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键?启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法①特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整