新型鸭病毒性肝炎病毒.ppt

3.4重复性试验结果经过3次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定可靠的。3.5临床样品检测结果用建立的N-DHV巢式RT-PCR检测方法，共检测了21份在不同地采集的鸭病料。检出阳性样品3份，对阳性样品PCR产物全部进行克隆与序列分析，结果均为N-DHV。第30页,共34页，星期六，2024年，5月4.讨论由于N-DHV在自然条件下感染成年鸭后，感染者可长期带毒和排毒而不出现临床症状，在这些情况下，病鸭组织中病毒含量较低，而且组织样品中因含有大量的蛋白和脂类等可能会影响PCR扩增，将反转录产物直接用于PCR扩增很难见到扩增片段。巢氏PCR(nestedPCR)是PCR的一种改良模式，是指利用2对PLR引物进行2轮PCR扩增反应。首先对靶DNA进行第1步扩增，然后从第1次反应产物中取出少量作为反应模板进行第2次扩增，第2次PCR引物与第1次反应产物的序列互补，第2次PCR扩增的产物即为目的产物。第31页,共34页，星期六，2024年，5月由于巢式PCR反应有2次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性;又有2对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。巢式RT-PCR技术通过反转录产物的PCR和巢式PCR的2次扩增，首次反应产物的转移有助于稀释掉那些最初可能存在于样品中的抑制物，大大提高了检测的灵敏度，避免了样品检测过程中的假阴性问题。巢式RT-PCR技术具有敏感性高、特异性强、快速高效等特点，为鸭病毒型肝炎的早期诊断提供了新的模式。本试验参考UenBank中己发表DHV-I和几株N-DHV的基因组序列，经过多重序列比对分析。选取DHV-I与N-DHV序列变化差异明显区设计合成2对新型鸭病毒性肝炎的特异性引物，建立了N-DHV检测的巢式RT-PCR检测方法，第32页,共34页，星期六，2024年，5月该方法只对N-DHV能够特异性地扩增出706bp和502bp的目的片段，而对NDV、IBDV、DEV、DPV的扩增结果均为阴性，具有良好的特异性，该方法第1次扩增的敏感性为10pg，第2次扩增的敏感性达到0.1Pg，敏感性提高了100倍，具有良好的敏感性。在21份临床样品的检测过程中，利用第1轮RT-PCR检测出阳性样品2份，而利用巢式RT-PLR检测时可以检出阳性样品3份，将所有阳性样品的PCR产物进行测序后，序列分析结果显示均是N-DHV，说明建立的巢式RT-PLR检测方法更为敏感、特异，可以用于原始病料中N-DHV的快速低含量检测，显示出了良好的应用前景。因此，本研究建立的巢式RT-PCR方法将为国内新型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查等提供一种简单快速的分子生物学诊断方法。第33页,共34页，星期六，2024年，5月鸭病毒性肝炎与鸭瘟鸭病毒性肝炎是引起雏鸭传播迅速和高度致死的传染病，病原为鸭肝炎病毒。鸭病毒性肝炎有3种血清型，在我国流行的主要为I型。一般多发于1～5周龄的雏鸭,对成年鸭没有影响。对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和pH值3的环境均有抵抗力。在56℃加热60分钟仍可存活，但加热至62℃，30分钟即被灭活。病毒在1%福尔马林或2%氢氧化钠中2小时、在2%漂白粉溶液中3小时、0.2%福尔马林37℃，30分钟均可使病毒灭活。鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的急性、高度死亡率的传染病，又称为鸭病毒性肠炎，俗称“大头瘟”鸭瘟病毒是疱疹病毒，病毒粒子呈球形。病毒对外界抵抗力不强。病毒对乙醚和氯仿敏感。病毒在pH值7～9时，经6小时不减低毒力，在pH值3和11时，病毒迅速灭活。各种年龄和品种的鸭均可感染，但鸭瘟流行时，成年鸭发病和死亡较严重，1月龄以下的雏鸭发病较少。本病于全年各季均可发生，但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通过消化道传播，也可通过交配、眼结膜和呼吸道而传播。第34页,共34页，星期六，2024年，5月新型鸭病毒性肝炎病毒1.1DHV的历史与分布鸭肝炎病毒(DHV)包括三个血清型，分别引起Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎。其中Ⅰ型鸭病毒性肝炎呈世界性分布。我国流行的鸭病毒性肝炎主要为Ⅰ型鸭病毒性肝炎，近年来陆续有新型鸭病毒性肝炎发现三个型之间无抗原相关性，没有交叉保护和交叉中和作用。DHV最早发现是在1945年由Levine在美国发现了Ⅰ型鸭病毒性肝炎。该病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法国、日本、美国和埃及等地流行、在我国广东、北京、浙江、福建、四川、安徽、广西、江苏、山东等地相继发生该病、目前几乎世界范围内主要养鸭地区均存在该病，给养鸭业带来了巨大的经济损失。