细胞培养的基本技术.ppt

细胞的冻存、复苏和运输教学目的1．掌握培养物的冷冻保存与复苏原理2．掌握冷冻保存的常用方法3．掌握冻存细胞的常用复苏方法4．掌握细胞运送的几种方法第30页，共55页，星期日，2025年，2月5日□1776年Spallanzani最早发表了“冷”处理对马精子生命活动的影响的报道，用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后，再将玻璃瓶放回室温下，精子又“复活”.□1900年前后，基本肯定生物成分能够在零下温度贮存的事实。□1949年至1960年称“甘油时期”。□1959年：二甲亚砜（DMSO）发展史第31页，共55页，星期日，2025年，2月5日一、培养物的的冷冻保存与复苏1．概念１）冷冻保存(cryopreservation)：是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。第32页，共55页，星期日，2025年，2月5日2）复苏(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程3）因细胞内部结冰而致的细胞损伤被称为细胞内冰晶的损伤(intracellularicedamage)。4）保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤或称溶液损伤(solutiondamage)第33页，共55页，星期日，2025年，2月5日原则：慢冻快融细胞的低温冷冻储存：是细胞培养室的常规工作和通用技术。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。⑴原理：在低于－70℃的超低温条件下，细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。第34页，共55页，星期日，2025年，2月5日⑵原则：缓慢冷冻当细胞冷到零度以下：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．冰晶就大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第35页，共55页，星期日，2025年，2月5日细胞冻存所用用品第36页，共55页，星期日，2025年，2月5日⑶慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min当温度达-25℃以下时，5～10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。第37页，共55页，星期日，2025年，2月5日液氮罐第38页，共55页，星期日，2025年，2月5日⑷低温保护剂的应用渗透性：具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等。常用的是DMSO，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第39页，共55页，星期日，2025年，2月5日第1页，共55页，星期日，2025年，2月5日教学目的1、掌握细胞培养操作基本要领和要求2、了解细胞培养常用的基本方法和操作要领无菌技术贯穿细胞培养的始终第2页，共55页，星期日，2025年，2月5日一、基本操作技术和要求第3页，共55页，星期日，2025年，2月5日一、培养室内的无菌操作第一节细胞培养操作基本要领和要求(一)培养前的准备有条不紊和安全可靠1.培养用物品的灭菌消毒(写出物品的清单)2.操作台的消毒(各种物品布局合理进行紫外线消毒30分钟;3.洗手和着装(原则上与外科手术相同)4.火焰消毒(酒精灯使用、金属器械、吸过培养液的吸管).第4页，共55页，星期日，2025年，2月5日（一）无菌操作培养前准备：准备好所需物品清点无误放置操作场所。培养室和超净台消毒：0.2％新洁尔灭拖地紫外线照射30-50min/d75%alcohol擦洗台面紫外线消毒勿照射培养细胞和培养液每天操作前第5页，共55页，星期日，2025年，2月5日洗手和着装：严格按照外科手术要求消毒着装，操作前75％alcohol消毒无菌培养操作：整个实验过程保持无菌操作。点燃酒精灯，一切操作在火焰附近烧灼进行。烧灼时间勿过长防止退火。洗过培养液的吸管不能再烧灼。橡胶物品不能烧灼时间过长。吸管不能混用。第6页，共55页，星期日，2025年，2月5日（二）培养