细胞培养基本技术全面知识普及.ppt

电子细胞计数器第94页，共138页，星期日，2025年，2月5日细胞计数板深度1mm，每个大方格是0.1mm3第95页，共138页，星期日，2025年，2月5日细胞计数操作制备单细胞悬液，吹打均匀后，转移一小部分样本（500ul）至1.5mlEP管中，加入等体积0.4％台盼蓝染液。75％酒精清洗计数板表面，注意不要划伤计数表面。将已染色待测细胞悬液吹打均匀，然后用移液器吸取20ul细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，液体刚好流到计数板凹槽边缘。注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。将计数板平放在显微镜载物台上计数。第96页，共138页，星期日，2025年，2月5日第97页，共138页，星期日，2025年，2月5日原代培养策略第62页，共138页，星期日，2025年，2月5日原代培养——分离小鼠胚胎第63页，共138页，星期日，2025年，2月5日原代培养——分离鸡胚第64页，共138页，星期日，2025年，2月5日原代培养——酶解组织第65页，共138页，星期日，2025年，2月5日内容细胞培养的理论背景设备与器材准备、溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存、复苏与运送常见问题及对策第66页，共138页，星期日，2025年，2月5日概念——“代”细胞分裂一次？错！培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。第67页，共138页，星期日，2025年，2月5日传代培养的要诀（一）该出手时就出手！该换液时就要换液，该传代时就要传代！否则，细胞就不是那个细胞细胞会衰退、分化、生长缓慢…………，多数情况下很难扭转和补救。第68页，共138页，星期日，2025年，2月5日传代培养的要诀（二）勤观察每天肉眼观察培养基颜色是否异常，有无混浊观察培养基颜色变化速度是否异常：变化过慢意味着细胞生长过于缓慢；变化过快而细胞密度并不大，表明有污染的可能性。镜下观察细胞形态、生长速度。观察培养箱水盘中的水是否干净。观察CO2压力表。观察液氮罐内液氮体积第69页，共138页，星期日，2025年，2月5日传代培养的要诀（三）严格无菌操作轻柔：避免机械力损伤细胞，重悬细胞时尽量用50ml离心管，通过晃动离心管分散细胞，尽量避免过力吹打。离心力不可超过300g（普通台式离心机水平转子1000rpm）。快速：防止因过分小心导致操作时间过长，增加污染概率。第70页，共138页，星期日，2025年，2月5日每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期平台期第71页，共138页，星期日，2025年，2月5日

每代贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度抑制。尽量避免细胞进入平台期。第72页，共138页，星期日，2025年，2月5日何时换液？ pH降低。培养基颜色由红变橙要警惕，变成黄色之前一定要换液。pH降至6.5时，细胞停止生长；降至6.0，细胞失去活性。无法挽救。发现细胞出现形态衰退时须勤换液若培养物密度过低或者生长缓慢，则更换一半培养基。第73页，共138页，星期日，2025年，2月5日贴壁细胞换液的操作 吸出或倒出旧培养基。加入同体积新培养基。第74页，共138页，星期日，2025年，2月5日悬浮细胞换液操作 将培养液移入离心管中1000rpm×5min离心弃上清加入新培养基重悬细胞。移入培养瓶，继续培养。第75页，共138页，星期日，2025年，2月5日何时传代？在对数生长末期传代不可在潜伏期传代第76页，共138页，星期日，2025年，2月5日贴壁细胞何时传代？ 细胞密度，90％汇合度。若继续放置超过24h，细胞将脱离细胞周期，再接种需要很长时间才能恢复。须频繁更换培养基时。理想的传代频率：1: