细胞培养相关技术.ppt

常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌第23页，共61页，星期日，2025年，2月5日抗生素的使用在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定第24页，共61页，星期日，2025年，2月5日完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位／毫升第25页，共61页，星期日，2025年，2月5日细胞培养基本方法（无菌原则）无菌工作台用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上。清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，严格注意无菌操作。第26页，共61页，星期日，2025年，2月5日细胞传代方法根据细胞生长的特点，传代方法有3种。悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第27页，共61页，星期日，2025年，2月5日贴壁生长细胞传代方法吸光培养瓶中的培养液适量PBS洗净残留培养液加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）加入培养液，终止胰酶消化作用用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液吸取1/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内将后者放入培养箱中培养第28页，共61页，星期日，2025年，2月5日细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。第29页，共61页，星期日，2025年，2月5日

冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第30页，共61页，星期日，2025年，2月5日慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min当温度达-25℃以下时，5～10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。第31页，共61页，星期日，2025年，2月5日低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第32页，共61页，星期日，2025年，2月5日细胞冻存方法预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期第33页，共61页，星期日，2025年，2月5日细胞复苏方法从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。5分钟内用培养液稀释