细胞融合的方法过程和影响因素.ppt

优点：融合率高，达70％－80％，甚至100％融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞第23页，共46页，星期日，2025年，2月5日???原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。???1）亲本???2）同核体homokaryon：同源细胞融合体，它们的基因型和表现型完全一样。???3）异核体heterokaryon：异源细胞的融合体，它们含有双亲细胞核和细胞质物质。???4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体???5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。???6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体第二节融合细胞的筛选第24页，共46页，星期日，2025年，2月5日动物细胞融合的筛选方式：1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长第25页，共46页，星期日，2025年，2月5日2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。第26页，共46页，星期日，2025年，2月5日3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长。第27页，共46页，星期日，2025年，2月5日4具有所需性状杂种细胞的筛选第28页，共46页，星期日，2025年，2月5日HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（Aminopterin，A）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种:需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:（催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸）次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶:（催化次黄嘌呤产生肌苷）主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻断FH2到FH4合成。第29页，共46页，星期日，2025年，2月5日杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤A培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。第30页，共46页，星期日，2025年，2月5日基于HAT培养基的筛选系统H（Hypoxanthine次黄嘌呤）应急途径中所提供之外源核苷酸前体A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成T（Thymidine，胸腺嘧啶）应急途径中所提供之外源核苷酸前体HGPRT酶缺陷型细胞株（长期培养系）不能在HAT培养液中生长正常细胞体外生存能力有限，最终也将死亡融合细胞最后，只有融合细胞在HAT培养液中存活第31页，共46页，星期日，2025年，2月5日第三节融合细胞克隆化利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。第32页，共46页，星期日，2025年，2月5日通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1）取出阳性孔内的细胞进行计数2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，每孔内将为一个细胞4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。有限稀释法第33页，共46页，星期日，2025年，2月5日在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞