PCR引物的设计与实验操作技巧.ppt

微生物基因工程李刚副教授

教学内容

一、PCR引物的设计与实验操作技巧聚合酶链式反响、分子克隆及DNA序列分析这三大类实验方法几乎构成了现代分子生物学的实验工作的根底。而三者中，PCR方法在理论上出现最早，在实践中应用得最广泛。

PCR反响的七种根本成份热稳定DNA聚合酶。一对特异的引导DNA合成的寡核苷酸引物。dNTP〔混合液：标准PCR反响包含4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。二价阳离子。所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，通常是Mg2+用于激活。一价阳离子。标准PCR缓冲液内包含有50mmol/L的KCl，它对于扩增大于500bp的DNA片段是有益的，提高KCl浓度在约70－100mmol/L范围内对改善扩增较短的DNA片段产物是有利的。模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研单链或双链形式参加PCR混合液中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但当使用高分子量的DNA〔10kb〕作模板时，如用限制性内切酶先行消化〔此酶不应切割其中的靶序列〕，那么扩增效果更好。

PCR引物设计的几条原那么：①引物长度一般引物长度为18-30碱基就足够了。特殊情况下〔比方Tm值或GC含量不适宜〕可以进一步延长到50-60bp长度。但超过60bp的引物长度比较少见。原因一是超过60bp长度的引物比较难以合成，因此合成价格大幅度增加。另外长引物在合成的时候出错率也显著增加。上下游引物的长度应该根本相等，最好相差不要超过3bp。

2.碱基组成G＋C含量应在40％到60％之间，4种碱基要在引物中分配均匀。假设是引物存在严重的GC倾向或AT倾向那么可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

3.重复和自身互补序列不能有大于3bp的重复序列或自身互补序列存在。这种序列可形成发夹结构，如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止寡聚核苷酸和靶DNA之间的复性。

4．上下游引物的互补性一个引物的3‘端不允许结合到另一个引物的任何位点上。因为在PCR中引物的浓度往往是比较高，所以即使引物间微弱的互补，都会导致引物间形成杂交，随后是引物二聚体的形成和扩增。如果引物二聚体在PCR早期形成，它将和DNA聚合酶、引物及核苷酸竞争进而抑制靶DNA的扩增。精心进行引物设计，应用热启动PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶〔如：AmpliGold，Perkin－Elmer〕都可以防止引物二聚体的形成。当在一个PCR中应用多对引物时，请注意检查任何一个3’末端都不能和其他任何引物互补。

5.解链温度〔Tm〕解链温度〔Tm〕：也称熔化温度。计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5?C。扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10?C。这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性。

为什么要计算引物的解链温度

解链温度的计算方法

6.3‘末端3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C，不能为A。然而，并不推荐使用3’端有NNCG或NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以促进发夹结构的形成，还可能产生引物二聚体。

7．向引物的5‘端添加限制性酶切位点，噬菌体启动子等序列有用而又不与靶DNA序列互补的序列一般加到引物的5’末端。一般来说，这些序列的存在不会显著地影响寡核苷酸和靶DNA之间的复性。这些附加序列包括噬菌体启动子和GC夹子。限制性酶切位点是一个特殊情况。因为位于DNA分子5‘末端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。

保护碱基确实定保护碱基确实定不是随意的，通常每一种限制性内切酶都有自己最正确的保护碱基。每一种限制性内切酶与其对应的最正确保护碱基请到NEB公司网站或互联网上查询。

8.引导位点的设置根据实验的不同目的，引导位点的设置可能会受到突变位点、限制性内切酶位点、编码序列、微卫星序列和顺式作用元件的影响。当针对cDNA模板设计引物时，正向和反向引物最好结合到不同外显子的不同区域。这些可以很容易地把来源于cDNA的扩增产物和来源于污染的基因组DNA的扩增产物区分开。

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PCR高保真酶推荐PE公司〔ABI〕Parken－ElmerDNA聚合酶，TakaRa公司的PrimeSTARHSPolymerase，ToYoBo公司的Kod－PlusPolymerase。

PCR产物的克隆

在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干