现代分子生物研究方法.ppt

5·3·1·1氯化铅密度梯度离心法质粒DNA一般仅占细胞总DNA的l%～2%左右，而且其化学结构与寄主染色体DNA之间并没有什么差别，所以，质粒DNA的纯化须从两者高级结构上的差异寻找依据。在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子质量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，大部分仍能保持完整的环状结构。方法：将含有EtBr的CsCl溶液加到大肠杆菌裂解液中，EtBr分子便会通过嵌入作用而结合到DNA链上，导致双螺旋结构发生解旋反应。大肠杆菌染色体DNA片段具有游离的末端而易于解旋，会结合大量的EtBr分子。共价闭合环状的DNA分子质粒，只能发生有限的解旋反应，限制了EtBr分子的结合数量，染色体DNA片段比质粒DNA结合更多的EtBr分子。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要比线性的染色体DNA片段具有更高的密度。通过氯化铯密度梯度离心之后，它们就会被平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。5·3·1·2碱变性法在pH值介于12.0～12.5的条件下加热DNA溶液，线性DNA会被变性，而闭合环状质粒DNA则不会被变性，尽管在这样的条件下连接DNA互补链之间的氢键也会断开，但由于闭合环状质粒DNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。与此相反，线性DNA的两条链则会完全分开。若用制冷或恢复中性的方法处理DNA混合物，质粒DNA能迅速而准确地复性，但随机断裂产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。可以用酒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。这目前最流行的方法。5·3·2重要的大肠杆菌质粒载体

5·3·2·1pSC101质粒载体pSC101是低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因(tetr)。该质粒具有EcoRI、HindⅢ、BamHI、SalI、XhoI、PvuⅡ以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单切割位点，在HindⅢ、BamHI和SalI等3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。pSClO1质粒具有可插人外源DNA的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，还具有四环素抗性的强选择记号，便于筛选。因此，它第一个被选为真核基因的克隆载体。这个质粒载体有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSClOlDNA，其产量就要比其他质粒载体低得多。5·3·2·2pBR322质粒载体为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号，又具有低分子质量、高拷贝以及外源DNA插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点的新的质粒载体。目前，在基因克隆中广泛使用的pBR322质粒，就是按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。pBR322质粒是由3个不同来源的部分组成的:含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四环素抗性基因(tetr)和DNA复制起点(ori)(图5-22)。pBR322质粒载体较小,其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段较大（6-8kb）的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。pBR322质粒载体具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号，方便选择。例如，将外源DNA克隆在BamHI位点上，将这样的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中，并涂布在含有氨卡青霉素的选择性培养基平板上，那么存活下来的菌落都将具有Ampr的表型，它们也必定是获得了编码有这种抗性基因的转化子。第三个优点是具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。5·3·3λ噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫作bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，系指吞噬之意。如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA片段，是一种良好的基因克隆载体。作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，这是因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。噬菌体有两种类型：溶菌周期（烈性噬菌体）：噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。溶源生长周期（温和噬菌体）：在感染过程中没有产生出子代噬