山羊痘病毒和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法征求意见稿.docx

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山羊痘病毒和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定山羊痘病毒和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法。

本文件适用于山羊痘和绵羊痘病毒的检测及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T3186羊冷冻精液生产技术规程

高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechainreaction）

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleicacid)

GPTV：山羊痘病毒（goatpoxvirus）SPPV：绵羊痘病毒（sheeppoxvirus）

PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline)Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNAploymerase）TEN缓冲液：Tris-EDTA缓冲液

5试剂和耗材

5.1试剂

5.1.1DNAzol，商品化DNA抽提试剂，于4℃~8℃保存。

5.1.2无水乙醇，-20℃预冷。

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5.1.375%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。

5.1.48mMNaOH溶液，配制见附录A。

5.1.5PBS缓冲液，0.01mol/LPBS，pH7.4，配制见附录A。

5.1.6Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，Taq酶反应缓冲液中Mg2+浓度为15mM。

5.1.7dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存，避免反复冻融。

5.1.8引物和TaqMan探针，其序列见附录B。

5.1.91.5mLEppendorf管。

5.1.100.2mLPCR薄壁管或八联管。

5.1.11山羊痘和绵羊痘病毒阳性对照样品：采用商品化山羊痘或绵羊痘病毒疫苗或接种了山羊痘和绵羊痘病毒的细胞悬液或者含有山羊痘和绵羊痘病毒目的基因的核酸。

5.1.12山羊痘和绵羊痘病毒阴性对照样品：采用绵羊羔睾丸细胞悬液或健康羊肉组织。

5.2引物

山羊痘和绵羊痘病毒实时荧光PCR扩增用上、下游引物和探针序列见附录B。

6仪器与设备

6.1超净工作台。

6.2荧光PCR扩增仪。

6.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。

6.4组织研磨器。

6.5普通冰箱。

6.6超低温冰箱：可控温至-70℃。

6.7微量移液器：0.2μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL，并配备与移液器匹配的吸头。

6.8高压灭菌锅。

7样品的采集与处理

7.1采样工具

7.1.1手术刀、剪刀、镊子，研等钵，经160℃干热灭菌2h。

7.1.2一次性无菌采样拭子。

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7.1.3真空采血管。

7.1.4记号笔。

7.1.5低温保藏箱。

7.2样品采集

7.2.1血清样本采集：用无菌注射器抽取受检山羊或绵羊静脉血不少于5mL，置于无菌离心管内，室温或者37℃倾斜放置自然凝集20min~30min，2000r/min~3000r/min离心10min，吸取上清液200μL

到新的离心管内备用。

7.2.2精液样品采集：按照NY/T3186的方法采集和保存精液。

7.2.3鼻拭子采集：用棉拭子取受检山羊或绵羊鼻腔分泌物，置于2mLPBS缓冲液中备用。

7.2.4组织样本采集：取活体或剖检羊的皮肤丘疹用于病毒分离和抗原检测。

7.2.5细胞培养物：待出现80%以上细胞病变时，将整瓶细胞冻在-80℃备用。

7.3样品送检

上述采集的样本可立即用于检测，样本在2℃~8℃下保存应不超过24h，-20℃±5℃可以稳定