DB22T 3031-2019 禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测法.pdfVIP

ICS11.220

B41

DB22

吉林省地方标准

DB22/T3031—2019

禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测法

OnestepfluorescentRT-PCRmethodforsimultaneousdetectionoftheAIVand

NDV

2019-05-27发布2019-06-17实施

吉林省市场监督管理厅发布

DB22/T3031—2019

前言

本标准按GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林大学。

本标准起草人：尹仁福、刘新鑫、丁壮、李俊娇、费亦东、范钦磊、肖玉海。

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DB22/T3031—2019

禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测法

1范围

本标准规定了禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的原理、试验条件、试剂或材料、仪器设

备、样品、检测方法和结果。

本标准适用于禽流感和新城疫病毒检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3原理

通过提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用

逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。通过该反

应，利用荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的

软件对产物进行分析，最终计算待测样品模板的初始浓度。

4试验条件

4.1生物安全要求

所有培养物和废弃物的处置应按照GB19489中的有关规定执行。

4.2防污染措施

4.2.1防止污染措施应符合GB/T27401的规定。

4.2.2实验室应根据实验要求分为相对独立的工作区域，避免不同工作区域内的设备、物品混用。每

一个区域应有专用的仪器设备。

5试剂或材料

5.1试剂

除有特殊说明外，所用试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T6682中一级水的要求。

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DB22/T3031—2019

5.1.1磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液pH值范围为pH7.0〜pH7.4，成分为青霉素2000U/mL、链霉

素2mg/mL、卡那霉素50µg/mL、制菌霉素1000U/mL。

5.1.2RNA提取试剂盒。

5.1.3荧光探针RT-PCR试剂盒。

5.1.4采用无新城疫、禽流感病毒的阴性质粒作为阴性对照。

5.1.5采用无RNA酶灭菌超纯水作为空白对照。

5.1.6采用已构建出的新流感、新城疫病的的阳性质粒作为阳性对照。

5.2材料

5.2.1棉拭子。

5.2.2雏禽新鲜粪便。

5.2.3死禽。采取病料包括脑、肺脏、脾脏。