植物细胞凋亡的检测方法.pptVIP

植物细胞凋亡的检测方法细胞凋亡（apoptosis）是指机体在一定的生理、病理条件下，为维持内环境稳定，通过基因控制而使细胞主动有序地死亡，且表现一系列形态和生化方面的特征。细胞凋亡是细胞正常的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用，不造成炎症和自体的损伤，是细胞为了更好地适应自下而上环境而主动争取的死亡过程。因这一死亡过程严格受到程序的控制，又称为细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD)。与凋亡不同，细胞坏死是指细胞在各种致损伤因素的作用下无序死亡的过程，形态特征为细胞胀大，特别是细胞器肿大，胞膜破裂，胞浆内容物外泄，而核变化较慢，DNA降解不充分，局部严重的炎症反应等。形态学观察法生化及分子生物学法免疫学方法生理学检测法近年来有不少综述著作分别介绍了植物发育过程中的细胞凋亡、环境胁迫诱导的细胞凋亡、植物细胞凋亡的机理及发育调控、在植物发育中的细胞凋亡作用、植物细胞凋亡与活性氧及抗氧化代谢的关系等，但对细胞凋亡的检测方法则很少报道。本文主要如要从以下方面对检测细胞凋亡的技术加以阐述。一、形态学观察法一、形态学观察法凋亡细胞的主要特征为核染色质致密，形成致密块，有时可碎裂。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。因此，可以对组织切片或细胞悬液进行形态学观察。可用如下方法进行观察：普通光镜观察法活细胞悬滴荧光染色镜检法凋亡小体电镜观察法等在普通光学显微镜下很难获得满意效果；荧光显微镜检测虽然简便易行，但其定量、定位并不可靠。而用透射电镜可以观察到凋亡不同时期的细胞结构变化，可对细胞凋亡提供最确切的证据。二、生化及分子生物学法梯状条带法细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，染色质DNA在核小体间被切割成50-300kb长的DNA片段，或180-200bp整倍数的单或寡核苷酸片段，在凝胶电泳时表现为特征性的梯形带。对于坏死细胞的DNA而言，基因组DNA的降解随机发生，在电泳胶上只能检测到连续分布的DNA条带。本法的优点是操作简便易行，定性准确，并可进行定量检测。但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。2.原位末端标记法原位末端标记法的基本原理，是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶激活而产生的单链或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。通常有2种方法：一、DNA聚合酶Ⅰ或Klenow大片段介导的原位缺口平移(ISNL)法。ISNL是利用DNA聚合酶将带有标记物的外源掺入的核苷酸整合到凋亡细胞内断裂的DNA3’-OH末端，通过合适的显示系统，观察是否有核苷酸掺入到DNA的断端。二、末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP缺口末端标记法(TUNNEL)。TUNNEL法是原位检测细胞凋亡最为敏感、快速、特异的方法，检测原理与ISNL相似，所介导的酶是末端脱氧核苷酸转移酶，该酶能将带有标记物的外源性核苷酸无需DNA模板连接到凋亡细胞DNA断裂的3’-OH末端上。由于其可靠性，TUNNEL检测成为目前植物细胞凋亡检测的首选手段。caspase活性检测法caspase（胱冬酶）是一类半胱氨酸蛋白酶，同时具有半胱氨酸和天冬氨酸裂解位点，它已被证明在动物的细胞凋亡中起着极其重要的作用，在植物中有可能也存在此类物质。因此，可以把检测caspase的活性作为检测细胞凋亡的辅助手段。三、免疫学方法酶联免疫吸附法本方法基于凋亡细胞内裂解的DNA片段含组蛋白（核小体），而DNA与组蛋白结合紧密而不被核酸内切酶切割。在微量板上吸附抗组蛋白抗体，加入细胞裂解后离心所得的含有核小体的上清液，核小体上的组蛋白与被包被的抗组蛋白抗体结合；加入辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体，与核小体上的DNA结合；加酶的底物，测光吸收值。该法敏感性高，所需细胞少，可检测到5×102的凋亡细胞，但缺点是不能定位。2.细胞色素c释放的检测法在植物细胞凋亡的初期也检测到细胞色素c的释放，因此也可以用细胞色素c的释放情况作为检测细胞凋亡的手段。3.多聚ADP核糖聚合酶降解情况检测法多聚ADP核糖聚合酶在DNA修复中起着重要作用，它是caspase-3的底物，近年来有不少证据证明PRPP的降解是植物细胞凋亡的特征之一。PRPP被caspase-3水解后形成相对分子质量分别为85000及25000的2个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡。