《 鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体鉴别检测二重TaqMan实时荧光PCR法》.docx

Q/LB.□XXXXX-XXXX

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ICS

FORMTEXT11.220

CCS

FORMTEXTGXAS

FORMTEXTB41

FORMTEXT团体标准

团体标准

T/FORMTEXTGXASFORMTEXTXXXX—FORMTEXT202X

FORMTEXT?????

FORMTEXT鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体鉴别检测

二重TaqMan实时荧光PCR法

DuplexTaqManreal-timePCRassayfordifferentialdetectionofMycoplasmagallisepticumandMycoplasmasynoviae

FORMDROPDOWN

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FORMDROPDOWN

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT广西标准化协会??发布

STYLEREF标准文件_文件编号T/GXASXXXX—202X

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鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体鉴别检测

二重TaqMan实时荧光PCR法

范围

本文件规定了应用二重TaqMan实时荧光PCR技术对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行鉴别检测的材料准备、操作方法及结果判定。

本文件适用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体的快速鉴别检测，可对临床样品及分离培养物进行检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

鸡毒支原体mycoplasmagallisepticum，MG

MG是柔膜体纲支原体目支原体科支原体属的成员。其易感动物主要为鸡和火鸡，尤其是2月龄内的雏鸡，可全年在鸡群中进行垂直和水平传播。患病鸡群主要表现为咳嗽、啰音等慢性呼吸道症状，导致肉鸡胴体品质降低，种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降。

鸡滑液囊支原体感染mycoplasmasyoviae，MS

MS是柔膜体纲支原体目支原体科滑液囊支原体属成员。其宿主范围包括鸡、火鸡和珍珠鸡，以4～12?周龄的鸡和10～12?周龄的火鸡多发，可水平传播，也可经种蛋垂直传播。患病鸡群主要表现为精神沉郁，采食减少，喜卧，跗关节和趾关节明显肿胀、变形，跛行，胸部囊肿；MS还可导致产蛋鸡产蛋量、蛋壳顶端质量和鸡胚孵化率显著下降，肉鸡饲料转化率和胴体品质急剧下降。

TaqMan实时荧光PCR

是指在PCR反应体系中加入基于TaqDNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。

二重TaqMan实时荧光PCR

在同一TaqMan实时荧光PCR反应体系中加入两对引物和两条荧光探针，以实现同时扩增并检测两条目的基因的目的。

缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BHQ1：黑洞荧光猝灭基团1（Blackholequencher1）

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）

MG：鸡毒支原体（mycoplasmagallisepticum）

MS：鸡滑液囊支原体（mycoplasmasynoviae）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

VIC：VIC亚磷酰胺（VICamidite）

检测材料

用于MG和MS鉴别检测的特异性引物

在MG的mgC2基因设计合成一对引物和荧光探针。

MG上游引物MG-F：5’-GGTGTTCTTCACGTTCTTGGATC-3’

MG下游引物MG-R：5’-GAAGGTGAAACTAAYTCCGTTGGT-3’

MG荧光探针MG-mgC2-P：5’-VIC-CGATCGGAATCCCAATCCCTAAACC-BHQ1-3’

在MS的vlhA基因设计合成一对引物和荧光探针。

MS上游引物MS-F：5’-TTRCTATTAGCAGCTAGTGCAGTGGC-3’

MS下游引物MS-R：5’-AGGATTATYAGTATTTGGGTTTCCAG-3’

MG荧光探针MS-vlhA-P：5’-