溶菌酶的作用机制.pptVIP

DetermingtheMechanismofLysozymeAction溶菌酶的作用机制制作:靳晶PARTONE溶菌酶是如何被发现的？因发现了青霉素以及它对多种传染性疾病的治疗作用，荣获1945年诺贝尔生理学或医学奖。亚历山大·弗莱明(AlexanderFleming)，1881年8月6日出生于苏格兰艾尔郡洛奇菲尔德。他是苏格兰低地农民的后裔，家境贫寒。1922年的一天，正在感冒的英国细菌学家AlexanderFleming发现，把一些鼻粘液加入细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶，Fleming命名其为溶菌酶（Lysozyme）。起初，Fleming对这种有杀死细菌活性的物质的实验不过是出于一种兴趣。但在目睹了一战中大量的士兵死于外伤感染之后，Fleming开始试图倾其毕生来寻找一种能够有效杀死细菌，同时又能对人类保持相对的无毒性的药剂。不象Fleming在1928年发现的青霉素(penicillin)，溶菌酶不能证明有临床价值。但是在酶机制的研究学习方面，溶菌酶扮演了一个很重要的角色。在1965年,DavidPhillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体（X-raycrystallography）结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构(tertiarystructure)。溶菌酶是从鸡蛋清中提炼的，蛋清里的溶菌酶可以保护胚胎在发育过程中免受细菌的感染。溶菌酶溶解细菌是通过水解细菌细胞壁多糖(thepolysaccharideofthebacterialcellwall)的糖苷键(glycosidicbonds)。而敏感细菌[革兰氏阳性细菌(gram-positivebacteria)]的细胞壁多糖是N-乙酰氨基葡糖（N-acetylglucosamine,NAG）-N-乙酰氨基葡糖乳酸（N-acetylmuramicacid,NAM）的共聚物，其中的NAG及NAM通过β-1，4糖苷键而交替排列。溶菌酶相对分子质量为14.6X103，由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有4对二硫键。溶菌酶分子近椭圆形，大小为。它的构象比较复杂，α螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的β片层构象。壹贰溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAGC1和NAMC4之间的β（1-4）糖苷键。几丁质是甲壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由NAG残基通过β（1-4）糖苷键连接而成，几丁质也是溶菌酶的底物。溶菌酶的内部几乎全部是非极性的(nonpolar)。疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。在溶菌酶分子的表面，有一个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性部位。PARTTWO底物与酶结合后，酶催化哪一个键水解呢？用大小不同的NAG寡聚体作底物测定被溶菌酶水解的相对速率，结果发现，少于4个糖的寡聚体水解速率甚小，当由四聚体增加到五聚体时，水解速率猛增500倍，五聚体增加到六聚体，速率增加近8倍，六聚体增加到八聚体，速率不再变化。这种情况与X射线晶体结构分析结果一致，活性部位所在的裂缝(cleft)正好被6个糖残基所装满。（NAG）3是溶菌酶的竞争抑制剂，因此A-B，B-C糖苷键均不可能是被水解的键。C环的空间对NAM来说体积太大，只能是NAG。C-D也不可能成为裂解的部位，而NAM不能适合到部位C中，进一步排除了另外一个裂解部位：E-F键。胞壁多糖是一个NAM和NAG交替的高聚物，从而NAM不能占据部位C时也就不能占据部位E。细菌的细胞壁多糖恰好具有NAM-NAG键，所以水解部位只能发生在D-E之间。用X射线晶体结构分析法研究了竞争性抑制剂（NAG）3仅仅占据了大约半个裂缝。从活性部位的几何大小看出酶的最小底物应该是（NAG）6。实验中用（NAG）6为底物，确实能被酶迅速水解。酶活性部位刚好能容纳一个六糖分子，A、B、C、D、E、F表示6个糖残基的位置，只是第4个糖残基D环因空间的原因必须由正常的椅式变形为能量较高的半椅式或“沙发”构造。因此糖苷键的稳定性减低，键就容易从这里断裂。进一步的问题是酶的催化作用，究竟键是在糖苷键原子的哪一侧被裂解的？回答这个问题可以在H218O溶液中酶促水解底物（NAG）6，发现只有D糖C1上含有18O，而E糖的C4羟基只含普通的O，由此可知这个键断裂在D糖基的C1和E残基的糖苷键的O之间。分析D-E键周围的微环境，最活泼的基团显然是Asp52和Glu35，它们分别位于糖苷键两侧。Asp52位于糖苷键的一侧，而Glu35在另一侧。这两个酸性侧链具有明显不同的微环