生物化学 Chapter 7 蛋白质的分离、纯化和表征.pptx

Chapter7蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的物化性质1.酸碱性2.大小和形状3.胶体性质二、蛋白质的分离和纯化方法1.一般原则2.根据蛋白性质进行分离纯化的方法三、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

一、蛋白质的重要性质1.蛋白质的酸碱性蛋白质分子中的可解离基团及其pKa值等电点(Isoelectricpoint,pI)等离子点(Isoionicpoint)

Molecularweight=(128-18)xNumberofresidualaminoacids2.蛋白质分子的大小与形状Proteinsareverylargemolecules

测定蛋白质分子量的方法1)根据化学组成测定最低分子量2)渗透压测定3)扩散系数测定4)沉降分析法5)凝胶过滤法6)电泳法

1）根据化学组成测定最低相对分子量ForExample,MolecularWeightofHemoglobinThefirstindicationthatproteinshavemolecularweightsgreatlyexceedingthoseofthe(thenknown)organiccompoundswasobtainedover100yearsago.Forexample,itwasknownatthattimethathemoglobincontains0.34%byweightofiron.(a)Fromthisinformationdeterminetheminimummolecularweightofhemoglobin.(b)Subsequentexperimentsindicatedthatthetruemolecularweightofhemoglobinis64,500.Whatinformationdidthisprovideaboutthenumberofironatomsinhemoglobin?

2）渗透压法Inanidealsolution,?=cRT/Mr（van’tHoff）Inarealsolution,?/c=RT/Mr+Kc尽量采用接近等电点的缓冲液作溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。

3）扩散系数法FirstlawFickdiffusion:dm/dt=-DAdc/dxSecondlawofFickdiffusion:dc/dt=Dd2c/dx2D—diffusioncoefficient,cm2.s-1Disdependentonboththesizeandshapeofproteinandviscosityofsolvent.

4）沉降分析法

沉降速度法

(Sedimentationvelocity)沉降系数:s=(dx/dt)/(?2x)沉降系数为10-13秒定义为1S（Svedberg）Mr=RTs/D(1-??)R=8.314J.K-1.mol-1=0.08206L.atm.K-1.mol-1

沉降平衡法

(Sedimentationequilibrium)当净离心力与扩散力平衡时，离心池中形成恒定的浓度梯度Mr=[2RTln(c2/c1)]/[(1-??)?2(x22-x12)]

CsCl密度梯度离心

5）凝胶过滤法

logMr=a/b–1/bVe/V0

6）电泳法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳logMr=K1-K2?R?R—相对迁移率

等电聚焦电泳

7）蛋白质分子的形状摩擦比f/f0=RT/(6??rND)(4?N/3Mr?)1/3阿佛加德罗常数N=6.0222?1023mol-1f/f0越大，蛋白质分子的不对称性越高

3.蛋白质的胶体性质水化层（hydrationmantle）和双电层（electricdoublelayer）盐析(saltingout)有机溶剂沉淀重金属盐沉淀生物碱试剂或酸沉淀加热变性沉淀

（一）分离纯化的一般步骤①原料的选择和预处理；②组织和细胞的破碎；③有效成分的粗提；④精制纯化；⑤干燥；⑥制剂及保存。二、蛋白质的分离提取方法

Separationpurificationofprotein

生物分离的一般流程

（二）蛋白质的分离提取方法1.根据蛋白质大小：离心、膜过滤、凝胶过滤（分子排阻）2.根据蛋白质的溶解度：盐析、有机溶剂沉淀、等