植物原生质体培养和细胞融合.pptVIP

离心5分钟（500-1000转/分），使悬浮的原生质体下降至离心管底部，缓缓倾倒出上清液。加入培养液，吹打使其悬浮，再离心，重复2次，目的是洗去酶液，使原生质体悬浮在等渗培养基中。第十章植物原生质体培养和细胞融合

10.2原生质体融合10.1植物原生质体培养主要内容原生质体（protoplast）：是去除细胞壁的裸露植物细胞。原生质体培养再生植株技术是细胞融合（cellfusion）和体细胞杂交（somaticcellhybridization）基础。第一节植物原生质体培养设备与工具除了需要组织培养的设备和工具之外，还需要一些用具。倒置显微镜荧光显微镜反照相设备普通显微镜：原生质体或细胞培养密度（采用血球计数板）倒置显微镜：观察培养皿、培养瓶或滴瓶中的培养物荧光显微镜：检查原生质体活性及去壁情况细菌过滤器45?m的滤膜可以滤去细菌和病毒用抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌用注射器推压过滤灭菌离心机提纯原生质体500r/min离心3-5min制备酶液用2500r/min离心10min化学试剂

无机化学试剂：分析纯

有机化学试剂：

维生素：组织培养常用的维生素以外还需泛酸钙，叶酸，VA，VC，VD，生物素，氯化胆碱，对甲基苯甲酸

激素：生长素和细胞分裂素的适当搭配

渗透压稳定剂：糖醇系统（甘露醇，山梨醇，葡萄糖，蔗糖）

碳源和氮源：C源：葡萄糖和蔗糖；N源：水解酪蛋白，谷氨酰胺，甘氨酸，Arg，Asp

凝胶剂：琼脂粉、琼脂糖、日本的GelloanGum01纤维素酶：日本的CellulaseonzukaR–10三、酶类02美国Cellulysin

果胶酶：日本的PectolyaseY23CellulaseonzukaRs03美国PectinaseMacerozyme原生质体的分离与纯化

外植体的选择

生长旺盛的植物体幼嫩部分

外植体有根、下胚轴、幼叶、子叶

选择处于对数生长早期的细胞或愈伤组织

酶解游离原生质体之前对植株进行预处理

（暗处理、低温处理、组培的培养基上培养）2、外植体灭菌：跟组培一样单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。3、酶处理静置在黑暗中进行

时间：几小时到十几小时

温度：25-27℃4、原生质体的收集和纯化收集：用40-100?m的滤网过滤混合液，将滤液以台式离心机75-100g离心3-5min。纯化：沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50g离心3-5min后再悬浮，如此反复洗涤2-3次。

为了纯化出有活力的原生质体，将沉淀悬浮于少量清洗培养基，置于含有蔗糖溶液（21%）的上部，在100g下离心5-10min后，在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上会出现一个纯净的原生质体带，将此带吸收后，再反复洗涤2次，最后用原生质体培养基洗一次。原生质体培养养基●2a（适用于茄科、玄参科、豆科、藜科）●2b（除去D2a培养基中的葡萄糖并及时补充蔗糖）般情况下：无机盐的大量元素含量稍低，钙离子含量较高，采用有机氮源而少用铵盐激培养方法液体培养微滴培养：将悬浮的密度为10000~100000个/ml原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴地接种到培养皿上，如果将培养皿翻转过来，则成为悬滴培养。浅层培养：将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。固液体混合培养：在培养皿底部先铺上一层琼脂培养基，待固化后，在固体培养基表面再作浅层液体培养。固体培养：原生质体悬液体+热融的含琼脂的培养基在45℃下等量混合。3、培养条件#2022单击此处可添加副标题单击此处添加大标题内容原生质体的发育原生质体在适合的条件下，首先形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成愈伤组织。原生质体植株再生途径：将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上，一步成苗。先将愈伤组织培养在含细胞分裂素和低浓度2.4-D的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。第二节原生质体融合（体细胞杂交）细胞融合的方法?自发融合（SpontaneousFusion）：在溶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体。?诱导融合（inducedfusion）：用物理或化学的方法来诱导原生质体的融合。步骤：两个或多个原生质体的质膜彼此靠近，局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，融合完成，形成球形的异核体或同核体。融合方法：物理方法（电融合）化学方法aNO3处理（异核体形成频率不高）高pH-高钙处理方法：pH在10.5、50mmol/LCaCl2?H2O37℃处理原生质体（杂种产量高