细胞的破碎与分离包涵体.pptVIP

细胞的破碎与分离概述

很多生化产物存在于细胞内(胞内产物)细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。胞内物分离药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α--干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤back细胞壁的组成和结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6-8%）脂类（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂类蛋白质细胞破碎01细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；02酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；03由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。细胞破碎珠磨法（Beadmill）高压匀浆器超声破碎法（Ultrasonication在15-25kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitationphenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。20Hz20000Hz正常人耳能听到的声音的频率范围超声次声撞击破碎化学破碎方法

01酸碱法02表面活性剂03有机溶剂通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。物理破碎方法渗透压冲击冻融法破碎率的测定细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。直接测定法目的产物测定法导电率测定法采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。05%美蓝染色结果基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程包涵体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。胞内表达：胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。包涵体的分离和蛋白质复性01指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包涵体：02表达量过高、过快形成原因：