球蛋白的分离纯化与鉴定.pptVIP

LOGOLOGO血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定实验十一扬州大学医学院生化教研室傅奕CompanyLogoContents实验目的与要求实验原理操作步骤结果分析1234CompanyLogo血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定一、实验目的与要求了解分离纯化蛋白质的基本原理；掌握柱层析技术。血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo二、实验原理本实验为一综合性大实验，目的是要从血清中获得纯化的?-球蛋白。血清中的蛋白质有两大类：清蛋白和球蛋白（?、?、?）。（一）如何分离得到球蛋白？盐析：清蛋白在水中的溶解度大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而绝大部分清蛋白保持溶解状态，依此可将球蛋白和清蛋白分离(离心）。得到球蛋白血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo凝胶层析（凝胶过滤）脱盐葡聚糖G-25纯化的球蛋白是选用孔隙大小一定的凝胶，将混合液中的小分子和大分子物质“筛”开来的一种分离方法。凝胶层析又称凝胶过滤，01实验原理（二）如何去除球蛋白中的无机盐（硫酸铵）？02血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo实验原理01如何分离得到纯化的?-球蛋白？02在乙酸铵溶液（pH6.5）中03?、?-球蛋白带负电荷04而?-球蛋白带正电荷05血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo二、实验原理（三）如何分离得到纯化的?-球蛋白？如何将带有不同性质电荷的蛋白质分离呢？离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的交换过程；带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，其分子带电形式为：纤维素-OC2H4N+H(C2H5)2，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo+血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo二、实验原理（三）如何分离得到纯化的?-球蛋白？因?、?球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合。而?-球蛋白带正电荷而不与DEAE纤维素进行交换结合，直接从层析柱流出。故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分蛋白质即为纯化的?-球蛋白。纯化前后的?-球蛋白可用电泳法进行比较鉴定。（四）如何鉴定?-球蛋白及纯度？实验原理血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo02010304盐析：分离球蛋白与清蛋白。离子交换层析：将?-球蛋白与?、?-球蛋白分离。凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐（脱盐）。电泳：鉴定?-球蛋白及纯度。血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo三、操作步骤1.盐析：分离球蛋白与清蛋白取血清0.75ml，缓慢滴入饱和(NH4)2SO4溶液0.75ml，边加边摇，混匀后于室温中放置10分钟，然后10000rpm离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加蒸馏水0.4ml，使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo三、操作步骤2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐（脱盐）（1）装柱：（a）固定层析柱，保持垂直。（b）排气，并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。（c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少许溶液。关闭出口。避免气泡、纹路，凝胶面始终低于液面。如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表层平整。血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定CompanyLogo三、操作步骤（2）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上然后打开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口小心加入少量乙酸铵（约1ml）洗层析柱内壁上的样品，打开出口，使溶液进入凝胶加入适量乙酸铵溶液开始洗脱并收集洗脱液，每分钟收集15滴淡黄色仔细清洗试管血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定