生物制药工艺技术基础.pptVIP

突变株筛选一般进程如图所示第三第四轮同第二轮0102第三第四轮同第二轮现代菌种选育技术：杂交育种：原生质体融合：基因工程技术(P55页)3．菌种保存（1）保存目的：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法①防止基因突变：如低温保藏②采用双重缺陷型③制作平行的菌种斜面，少传代④分离单菌落，自然筛选⑤选择培养条件菌种保藏方法：0201030405液体石蜡封藏法斜面低温保存甘油冷冻法液氮保藏法冷冻干燥法二、发酵工程技术基础发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。液体培养——深层发酵固体培养——浅盘培养发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备，以L-Lys生产设备为例，见图1所示。图1L-Lys生产过程工艺设备图第三节生物技术药物制造技术基础

组DNA技术原理基因工程操作过程：

获得目的基因；构建DNA重组体；将重组体导入宿主细胞；工程菌的克隆与鉴定；目的基因扩增与蛋白表达。基因工程药物制造过程二、基因工程主要操作技术1．目的基因的获得（1）cDNA文库纯化目的mRNA，逆转录成cDNA①mRNA的分离②cDNA第一链的合成③cDNA第二链的合成④cDNA与载体连接⑤转染或转化⑥筛选目的克隆目的基因的获得：cDNA文库（2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）典型PCR反应包括①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸。化学合成法在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。2．DNA重组体的构建根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector）（1）E.coli质粒非表达型pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，λ噬菌体DNA作为载体，非表达型λgt10，表达型λgt11。（2）芽孢杆菌pUB110pE194和pC194（3）链霉菌pIJ101pSG5cDNA与载体连接方法①同聚尾连接法②人工接头连接法重组体的表达系统原核表达系统01E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces02优点：易大量生产，成本低，周期短03缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性04真核表达系统酵母表达毕赤酵母（pichiapsatoris）受甲醇诱导优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。动物细胞哺乳动物细胞——CHO（仓鼠细胞）昆虫细胞——家蚕细胞123454．表达产物的纯化包含体inclusionbodies:大部分是表达产物，（还有细胞蛋白和膜蛋白）一级结构正确、无活性，不溶于水，可用变溶剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。为防止或减少包含体的形成常用方法：降低培养温度从37℃降到30℃可显著降低包含体形成率。以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。硫氧还原蛋白是E.coil的一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，表达产物聚集于粘附区，通过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目的蛋白。三、酶工程制药技术基础1、酶工程(enzymeengineering)研究内容（1）酶的发现、分离纯化与生产应用。（2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）抗体酶、模拟酶合成酶及酶的人工设计。（书P102）固定化酶(immobilizedenzyme)固定化稳定性提高可重复使用、提高使用效率、降低成本提高强度，便于连续、自动、规模化生产便于产物的分离、纯化酶的固定化技术和固定化酶共价键结合酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续3、制备方法：（1）吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法（2）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚