组织化学技术4-酶组化.pptVIP

第二章酶组织化学Inruduction酶组织化学（EnzymeHistochemistry）是利用组织细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。一般是用冻结或固定的切片，再一定条件下（具有酶的底物等）全酶进行催化作用，产生一种可见产物，沉淀在酶所在的部位，最终通过显微镜对酶的活性进行定位或定量研究。*1※特点：①在原位检测②检测酶的活性而不是酶分子本身酶的分类：按生物化学分类——六大类①氧化还原酶②转移酶③水解酶④裂解酶⑤异构酶⑥连接酶常用检测方法1．沉淀法①金属沉淀法：Ca++—Co++法；Pb法②偶联法：重氮盐法③靛原法④四唑盐法22．后偶联法Post-coupling（ACP）3．合成法4．底物膜法设计半透膜切片/孵育法★★★影响酶组化实验的关键因素①酶活性的保存a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不同的酶适用不同的固定剂△抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。△慎用醛3b）取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮∶氯仿=1∶1）4℃，5～10分钟，但脂溶性蛋白脱落。②底物浓度A）量要足够1∶20V/VB）孵育法只能用一次，配制时要适量（节俭）③PH和渗透压应以缓冲液调节④温度控制与时间：室温37℃（40min）4℃（5～10min）4⑤捕获剂亦要求一定浓度，要以反应原位瞬时沉淀。⑥激活剂与抑制剂（对照）a）两者的选择都应具有特异性。b）要有适当的浓度范围⑦时间：通过实验自行摸索。任何配方都是一个很大的范围（指时间），受多种因素的影响，因药品的质量、环境因素的变化而变化。故不可轻信之。⑧扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻切片孵育尤应注意）5⑨对照：必须设立对照，以防非特异反应。这对结果的解释非常重要。★★★对结果的分析，应考虑如下几个问题：①经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟能保留多少？②酶是否在原位？③反应中多少酶起了作用？④酶的活性是否代表细胞生活时的活性？⑤沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延长，会不会改变？⑥是否有扩散移位6一、钙—钴法显示碱性磷酸酶

AlkalinePhosphatase（ALP）〔原理〕以天然存在的β—甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下：7〔方法〕标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）厚6微米。固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃2~5′①切片标本入下列孵育液中，37℃，5分钟孵育液：3％β—甘油磷酸钠6ml底物保2％巴比妥钠6ml调PH证2％氯化钙（无水）9ml沉淀剂新2％硫酸镁6ml激活剂鲜蒸馏水3ml30ml将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。流水流水洗2分钟后→入蒸馏水入2％