细胞工程及其在食品工业中的应用.pptVIP

细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；融合成巨大细胞，仍需ATP。仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：一、仙台病毒法病毒促使细胞融合的主要步骤如下：1两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。2用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图010203040506优点是易得，用法简单，融合效果稳定。聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生最多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。二、聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。?12将两种不同亲本细胞各5×l06混匀；1离心沉淀，吸去上清液；2加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；3加9ml培养液，离心沉淀，吸去上清液；4加5ml培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至5ml，37℃的CO2培养箱中培养。56—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。6聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。三、电融合法细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；01膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。02电融合的基本过程：电融合诱导法原理示意图杂种细胞的筛选logo细胞冷冻贮存器细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。培养器皿培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。分析间：显微镜、计算机及打印机等。由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20～30分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。洗手操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。无菌操作的要领21所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带入培养液。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。43火焰消毒合理布局右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立,易增加落菌机会）。吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。0103023.动物细胞培养的条件1.无菌无毒的环境2.营养3.温度和pH4.气体环境