基因测序技术分子生物学检验技术生物化学检验教研室90课件.pptx

分子生物学检验技术基因测序技术生物化学检验教研室

学习目标掌握：DNA测序技术的基本原理、主要步骤熟悉：第一代DNA测序技术的体系组成了解：自动化测序的方法

目录双脱氧链末端终止法01化学降解法02自动化测序03CONTENTS分子生物学检验技术CONTENTS

自动化测序PART03

自动化测序新一代测序技术/NGS/高通量测序/二代测序：特点：高通量快速基因组测序、转录谱分析、ChIP测序等大规模DNA测序分析。

自动化测序测序平台测序原理开发公司454焦磷酸合成测序RocheSolexa、Hiseq边合成边测序IlluminaSOLiD连接DNA测序ABI

自动化测序

自动化测序

自动化测序

Illumia测序利用可逆终止的荧光dNTP，边合成边测序。

原理将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flowcell流动池），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flowcell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。

芯片处理Flowcell，流动池8条通道；内表面做了化学修饰：两种DNA引物种到玻璃表面（共价键连接）。两种DNA引物与DNA文库的接头序列互相配对。

DNA文库DNA片段两端接上人工接头基因组，打断，成为片段核苷酸序列不同，未知接头可以和引物碱基互补配对。

DNA文库

桥式PCR将文库加入到芯片上，进行扩增的过程。通过文库两端的人工接头和芯片上的2种引物互补，从而连接。dNTP和聚合酶作用下，开始延长。形成新的互补DNA链。

桥式PCR加入NaOH，后解开双链，其中没有共价结合于芯片上的那条链被冲走。加入中性液体，稀释碱液后，DNA链另一端引物与芯片的另一引物配对，形成桥。

桥式PCR加入聚合酶和dNTP，在桥上重新合成新链。加入碱，将两条链解开。再加入中和液，链再与芯片引物杂交。如此反复指数增长

测序加入可逆终止的荧光dNTP：链接臂荧光基团叠氮基团：阻止聚合，巯基试剂可使叠氮基断裂，恢复3’羟基。

测序边合成边测序加入测序引物，可逆dNTP，DNA聚合酶。每次只延长一个碱基。在激光下确定颜色，即哪个碱基。用试剂去掉荧光和叠氮基团。继续延长下一个碱基。

Illumia1

Illumia2

Illumia3

测序

第三代测序技术01它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。02它的精度非常高，达到99.9999%。0304可直接测RNA序列。05可直接测甲基化的DNA序列。

自动化测序DNA测序技术经过30多年的发展，目前已经到了第三代，三代测序技术有各自的优势。第一代测序技术虽然成本高，速度慢，但是对于少量的序列来说，仍是最好的选择，所以在以后的一段时间内仍将存在；第二代测序技术刚刚商用不久，正在逐渐走向成熟；第三代测序技术有的刚刚出现，有的则正在研制，相信很快便可进行商业化运作。可以预见，在未来的几年里会出现三代测序技术共存的局面。

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