生物化学实验.ppt

实验内容与结果（一）AKP的提取匀浆→抽提→丙酮、乙醇反复沉淀→AKP纯酶液注意事项：所用有机试剂必须预先预冷。提取过程中所有有机试剂浓度应计算准确，加量准确。各阶段提取液需取出部分待测比活性。第30页，共52页，星期日，2025年，2月5日（二）AKP比活性测定1、样品酶活性测定：酶活性单位计算：在37℃下保温15分钟产生1毫克酚，称为该酶的1个活性单位（U）。计算每毫升酶液的酶活性单位（U/mL）2、样品酶蛋白含量测定：计算每毫升酶液的蛋白含量（mg/ml）3、比活性计算：比活性（U/mg）=每毫升酶液的酶活性单位/每毫升酶液的蛋白含量4、注意事项：注意各阶段的稀释倍数及取样量。各管加样量要准确，注意反应时间。第31页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验七碱性磷酸酶酶促反应动力学实验第32页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验要求了解酶促反应动力学的研究内容及意义通过检测不同温度条件下AKP的活性，了解温度对酶活性的影响学习测定酶最适pH的方法，了解pH对酶活性的影响了解底物浓度对酶促反应速度的影响，学习测定米氏常数（Km）的原理和方法。第33页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验原理酶促反应动力学是研究酶促反应速度以及影响此速度的各种因素的科学，如底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等，进行酶促反应动力学研究具有重要的理论和实践意义。酶的催化作用受温度的影响。当温度达到某一定值时，酶促反应达到最高峰，此温度称为酶的最适温度。第34页，共52页，星期日，2025年，2月5日酶的活力受环境pH的影响极为显著。通常只有在一定的pH范围内，酶才表现其催化活性，且在某一pH时，酶的活性才达最大值，称为最适pH值，不同酶的最适pH值不同。在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应速度（V）随底物浓度（[S]）的增加而迅速增加；但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小；当底物浓度增加至某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vm）。Km值是酶的一个特征常数，是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。Km可以近似表示酶与底物的亲和力，测定Km是酶学研究的一个重要方法。第35页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验内容1、温度对酶活性的影响2、pH对酶活性的影响3、底物浓度对酶活性的影响（Km的测定）第36页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验结果1、比较各种温度对AKP酶活性的影响，确定其最适温度。2、比较各种pH对AKP酶活性的影响，确定其最适pH值。3、以酶活性单位代表各管中酶反应速度(v)作纵坐标，以底物浓度（[s]）为横坐标，连接各点，观察该图形的形状。以酶活性单位的倒数（1/v）为纵坐标，底物浓度的倒数（1/[s]）为横坐标，在坐标纸描出各点并连接，求该酶的Km值。第37页，共52页，星期日，2025年，2月5日第1页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验一总糖的测定——蒽酮比色法第2页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验要求掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法掌握72型分光光度计的原理和操作方法学习通过制作标准曲线测定未知物含量的方法第3页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验原理糖类在较高温度下经浓无机酸作用脱水产生糠醛或糠醛衍生物，可与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，颜色深浅与糖量成正比。本法多用于测定糖原含量，也可用于测定葡萄糖含量。第4页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验内容与结果1、制作葡萄糖标准曲线2、测定样品含糖量计算100克小麦面粉中总糖含量第5页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法第6页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验要求学习分配层析法的原理掌握氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色及鉴定）第7页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验原理纸层析法是以滤纸作支持物，纸纤维上的羟基具有亲水性，能吸附一层水作固定相，而与水不相混合的有机溶剂作流动相，因此利用分配层析原理，不同物质在两相间有不同的分配系数而在纸上移动的距离不同，即被分开。本实验分离的是混合氨基酸样品，层析之后用茚三酮试剂显色。第8页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验内容与结果1、点样2、展层3、显色用铅笔描出显色斑点的形状，测其距离并计算各氨基酸的Rf值。第9页，共52页，星期日，2025年，2月5日实验三蛋白质的等电点测定及