细胞工程7胚胎干细胞培养.pptVIP

1、基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育过程中重要而基本的现象；ES细胞是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导分化的途径可能与在体胚胎细胞的不完全相同；在体胚胎的细胞分化过程中，诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力(competence)。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制；ES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式不尽相同，按其作用机理大致分为两类：--使被诱导细胞可逆性轻度损伤，导致神经细胞分化无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等--诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。ES细胞体外诱导分化途径可分为：-谱系分化（lineagedifferentiation），有利于认识组织谱系细胞分化机理和全过程。ES细胞谱系祖细胞谱系定型细胞终末分化细胞-定向分化（committeddiffereniation），需设法控制导向产生单一类型的分化细胞。对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径2、ES细胞体外诱导分化的基本方法ES细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较单层ES细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞软琼脂培养悬滴培养单一,具体方法有：制备ES单细胞悬浮液培养皿盖上接种20ul/滴，直径10cm的培养皿盖盖上带有悬浮细胞小滴的盖子培养皿内加PBS培养皿边缘用膜封置37℃，5％CO2培养箱培养3d后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养然后,移放入铺有0.1%白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养可被诱导分化为不同类型细胞ES细胞体外悬滴培养3、ES细胞体外诱导分化举例造血细胞01内皮细胞与血管02神经细胞03脂肪细胞04心肌和其他肌肉细胞05软骨细胞06胰岛细胞07造血细胞小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构并分化产生各种造血系统的细胞：用胰蛋白酶消化小鼠ES细胞拟胚体成单个细胞，经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和条件培养液处理，诱导其定向分化为造血干细胞；用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及IL-6细胞因子处理可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为B淋巴细胞系。小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构，其中也有内皮细胞出现：利用经转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染的小鼠ES细胞在含RA培养液中经悬滴培养形成拟胚体；再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。将外源重组TGF-β1添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。logo悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞拟胚体在RA诱导条件下贴壁生长数天，常出现某些分化细胞集落具有节律性自发收缩的现象，显然是肌细胞：DMSO诱导ES细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞，用肌肉专一性的调节因子MyoD基因转染ES细胞并结合DMSO诱导处理，额外表达MyoD基因的ES细胞主要分化为骨骼肌且常融合成肌管。ES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导条件选择等手段，是一条可能的探索ES细胞定向诱导分化的途径。四、ES/EG细胞诱导分化细胞的永生化寻找建立ES/EG细胞诱导产生的分化细胞永生化途径是目前ES/EG细胞研究领域待解决的问题。ES/EG培养与诱导分化的意义人体的基因和细胞治疗哺乳类发育的体外模型组织工程的种子细胞来源01030204哺乳类发育的体外模型哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；ES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答能力。虽然ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系；许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞体