质量控制贯穿检验全流程分子生物学检验技术生物化学检验教研室94课件.pptx

分子生物学检验技术质量控制贯穿检验全流程生物化学检验教研室

目录临床PCR检验标本的采集和质量控制01临床PCR检验的室内质量控制02CONTENTS分子生物学检验技术CONTENTS

临床PCR检验的室内质量控制PART02

室内质量控制通过采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作可靠性程度的一项工作，也是实验室内为达到质量要求的操作技术和活动。分子诊断检验项目应有室内质量控制程序以保证结果的可靠性，应有针对核酸检测防污染的具体措施。定量测定可《临床实验室定量测定室内质量控制指南》（2006）。

室内质控应监控核酸提取核酸扩增产物分析核酸提取效率要求扩增效率要求

质控品的分类、选择01阳性质控物含有检测程序的突变、变异体或核酸靶标的质控品购买卫生部临检中心或厂家。自制（DNA质控物）：将阳性血浆样本混合后，离心取上清，检测DNA拷贝数；然后，用健康人血浆进行稀释至所需浓度，分装、密封后冷冻保存，每次取1管与临床样本同步检测。02阴性质控含有正常或“野生型”序列的质控标本。可自制，取正常人血浆或血清。03无模板质控含有除了待扩增的核酸模板之外的扩增程序的所有组分的样品。常用于检测核酸扩增期间的交叉污染。

质控品的选择定性检测项目质控品的选择定量检测项目质控品的选择每次实验应设置阴性、弱阳性（灵敏度质控品）、和/或阳性质控物质。CNAS-GL029：2018《基因扩增领域检测实验室认可指南》中要求：基于基因扩增检测方法结果的可靠性，每个基因扩增检测步骤均应设置阳性质控对照、阴性质控对照和空白对照，当一种对照达不到预期结果时，以一定的时间间隔加入其他对照方法。每次实验应设置阴性、弱阳性、阳性质控物质。质控品浓度应在检测的线性范围内，尽可能选择与医学决定水平或其接近的浓度，至少包括两个浓度水平，用于确认该项目的分析性能。

质控物使用的功能核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或反转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。弱阳性质控样本最常见的失控原因：

质控物使用的功能阴性原血清质控样本的功能：监测实验室的以前扩增产物的“污染”；由实验操作所致的标本间的交叉污染；强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染；强阳性标本经操作者的手所致的污染；使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开。扩增反应试剂的污染：阴性质控检测如为阳性，说明上述3外环节中有可能一个或几个问题存在，但并不能区别究竟在哪点上发生了污染，所以在实验中带入一个空白管。

质控物使用的功能反应液空白管1：可监测试剂是否受“污染”。试剂空白管2：在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内30-60min，然后进行扩增，如出现阳性，在反应液管1为阴性的情况下，提示可能存在有实验室污染。空白管的功能：

质控品的位置应尽可能随机而不应该固定01核酸提取：在核酸提取的整个过程中，阴阳质控品应随机均匀分散在临床标本的中间，以充分反映实际检测可能存在的问题。02扩增：质控样本在扩增仪中的位置不应持续性的固定在同一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，尽可能在一定时间内可以监测到每一孔的扩增有效性。03杂交：在板上杂交和斑点杂交时，质控品应该在同一块板或同一张膜上与患者样本平行进行分析。

室内质控规则定性检测项目：采用非统计学方法方法，其质控结果应阴阳性符合预期，否则失控。定量检测项目：采用统计学方法。阳性样本测定重复性统计质控方法：假阳性的统计质控方法包括：根据日常患者结果阳性率的“半L-J质控图”直接概率计算法。基线测定L-J质控图方法Westgard多规则质控方法

常用质控规则的符号及定义符号定义12S一个质控测定值超出±2s控制限13S一个质控测定值超出±3s控制限22S两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限R4S同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限41S四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限10X十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧

室内质控数据实验室指定负责人应酶与审核和分析质控数据实验室应在报告患者结果前审核质控数据，当质控失控时，不能报告患者结果，并且需要记录采取纠正措施。

质控记录日常质控记录应包括：01检验项目名称，方法学名称，分析仪器名称；02试剂生产商名称、批号及有效期；03质控物生产商名称、批号和有效期，质控品在开瓶使用时要记录。

其他质量控制指标核酸提取质量扩增效率核酸纯度：按检验程序提取标本核酸，将核酸提取液用分光光度计测定A260/280比值。要求待测物质位DNA时，比值在1.7-1.9之间；待测物质位RNA时，比值