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检测动物产品中水貂阿留申病毒和犬细小病毒复合PCR方法的建立和应用

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检测动物产品中水貂阿留申病毒和犬细小病毒复合PCR方法的建立和应用

摘要：本文针对动物产品中水貂阿留申病毒（MVRV）和犬细小病毒（CPV）的检测需求，建立了基于复合PCR的方法。首先，通过设计特异性引物，优化PCR反应条件，实现了对MVRV和CPV的快速、灵敏检测。该方法在动物产品样本中的检测结果显示，对MVRV和CPV的检测限分别为1fg/μL和5fg/μL，特异性试验表明该方法对其他动物病毒无交叉反应。应用该复合PCR方法对实际样品进行检测，成功检出MVRV和CPV阳性样本，证明了该方法的实用性和可靠性。本研究为动物产品中MVRV和CPV的检测提供了新的技术手段，对保障动物产品安全具有重要意义。

水貂阿留申病毒和犬细小病毒是两种重要的动物病毒，分别感染水貂和犬，引起严重的疾病。近年来，这两种病毒在动物产品中的检出率逐年上升，给动物养殖业和公共卫生安全带来了严重威胁。传统的检测方法如病毒分离培养、抗原抗体检测等，存在操作复杂、耗时较长、灵敏度低等缺点。因此，建立快速、灵敏、特异的检测方法是当前动物病毒检测领域的研究热点。聚合酶链反应（PCR）技术因其灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，被广泛应用于病毒检测。本研究旨在建立一种基于复合PCR的方法，用于同时检测动物产品中的MVRV和CPV，以提高检测效率和准确性。

一、1.材料与方法

1.1样本收集与处理

(1)样本收集工作严格遵守相关法规和操作规范，确保样本的代表性。样本来源包括不同地区、不同养殖场的动物产品，如肉、皮、内脏等。样本采集后，立即进行封装，并置于冰袋中保持低温运输至实验室。到达实验室后，迅速进行样本处理，防止病毒活性降低。

(2)样本处理包括样本的初步破碎和核酸提取。初步破碎采用组织匀浆器对组织样本进行破碎处理，确保病毒核酸充分释放。随后，使用商业化的核酸提取试剂盒按照说明书步骤提取病毒核酸。提取过程中严格控制操作条件，如温度、pH值等，以保证核酸提取效率。

(3)提取的病毒核酸进行浓度测定和纯度鉴定，以确保后续PCR反应的顺利进行。使用分光光度计测定核酸浓度，并利用琼脂糖凝胶电泳对提取的核酸进行纯度鉴定。对于不合格的样本，重新进行核酸提取，直至满足实验要求。所有样本处理过程均在超净工作台中完成，以防止污染。

1.2引物设计与合成

(1)针对水貂阿留申病毒（MVRV）和犬细小病毒（CPV）的基因序列，利用生物信息学软件进行同源性分析和引物设计。首先，收集并比对MVRV和CPV的保守基因序列，以确保引物设计的特异性。通过BLAST在线工具筛选出与MVRV和CPV高度同源的基因序列，然后使用PrimerPremier5.0软件设计引物。设计过程中，引物长度控制在18-25个碱基之间，GC含量在40-60%之间，以确保引物的稳定性和扩增效率。

(2)为了提高复合PCR方法的灵敏度和特异性，对设计的引物进行优化。通过模拟退火温度、引物浓度和延伸时间等参数，确定最佳的PCR反应条件。使用PrimerBLAST在线工具对设计引物进行验证，排除与已知基因序列的潜在交叉反应。此外，通过构建引物二聚体和引物二聚体与模板DNA的结合能分析，进一步优化引物序列，降低非特异性扩增的风险。

(3)引物合成采用高保真DNA聚合酶和合成仪进行。合成过程中，使用高质量的反向合成策略，确保引物序列的准确性。引物合成后，对合成的引物进行质谱分析，检测其纯度和分子量。合格引物以10μM的浓度储存于-20°C冰箱中，以便后续PCR实验使用。引物合成过程中，严格控制反应条件，确保引物的质量和稳定性。

1.3PCR反应体系优化

(1)PCR反应体系优化是确保复合PCR方法灵敏度和特异性的关键步骤。首先，对PCR反应的模板DNA浓度进行梯度实验。通过设置不同的DNA浓度梯度，观察PCR反应的扩增曲线，确定最佳模板DNA浓度。实验结果显示，在模板DNA浓度为10ng/μL时，PCR反应的扩增效果最佳，此时MVRV和CPV的扩增产物均达到饱和状态。

(2)其次，对PCR反应的退火温度进行优化。通过设置不同的退火温度梯度（55-65°C），观察PCR反应的扩增效果。实验发现，当退火温度为60°C时，MVRV和CPV的扩增产物特异性最强，且扩增效率最高。在此退火温度下，引物与模板DNA的结合更为稳定，有利于提高PCR反应的特异性。

(3)此外，对PCR反应的延伸温度和循环次数进行优化。通过设置不同的延伸温度（72-75°C）和循环次数（2