高效液相色谱法简介.ppt

*§5-2定量分析HPLC色谱定量的基本方法有内标法、外标法等。外标法———标准曲线法是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法则是相对定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。第30页，共43页，星期日，2025年，2月5日*具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。第31页，共43页，星期日，2025年，2月5日*第1页，共43页，星期日，2025年，2月5日*液相色谱分析是在经典的液体柱色谱基础上，引入了气相色谱的理论；在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术被称做高效液相色谱法。高效液相色谱分析概述第2页，共43页，星期日，2025年，2月5日*慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液第3页，共43页，星期日，2025年，2月5日*叶绿素的柱色谱第4页，共43页，星期日，2025年，2月5日*三组分混合物的分离第5页，共43页，星期日，2025年，2月5日*在C18柱中，三组分混合物流出色谱柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数有关：K=化合物在固定相中的浓度C固化合物在流动相中的浓度C流K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用强，后流出柱子。第6页，共43页，星期日，2025年，2月5日*第7页，共43页，星期日，2025年，2月5日*键合相-反相色谱第8页，共43页，星期日，2025年，2月5日*§1.概述色谱法：(chromatography)：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。第9页，共43页，星期日，2025年，2月5日*§1-4高效液相色谱法的特点一高压液相色谱以液体作为流动相（称为载液），液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在现代液体色谱中供液压力和进样压力都很高，一般可达到150～300kg／cm2，甚至可达700k／cm2以上。第10页，共43页，星期日，2025年，2月5日*二高速高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达l—10mL／min，个别可高达100mL／min以上，这已近似于气相色谱的流速。三高效气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达60000理论塔板／米；第11页，共43页，星期日，2025年，2月5日*四高灵敏度紫外检测器的最小检测量可达毫微克数量级(10-9g)；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少；微升数量级的样品就足以进行全分析。第12页，共43页，星期日，2025年，2月5日*§1-5高效液相色谱流程和设备高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。第13页，共43页，星期日，2025年，2月5日*第14页，共43页，星期日，2025年，2月5日*样品吸收度测定—吸收池示图第15页，共43页，星期日，2025年，2月5日*紫外检测器工作原理第16页，共43页，星期日，2025年，