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实验六DNA琼脂糖凝胶电泳

1.实验目的要求（Purposeandrequirement）掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。

2.实验原理（Experimentprinciple）在pHpI时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；结构均匀，含水量大，样品不易扩散；无紫外吸收，过程中和结果可直接用紫外监测；电泳后区带易染色，便于观察；琼脂糖是半乳糖及其衍生物构成的中性物质，从海洋植物中提取的。优点：

在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。

溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下桔红色荧光显色：当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA分子的构象电源电压嵌入染料的存在离子强度影响影响DNA迁移率的因素

不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围琼脂糖浓度（W/V,%）分离范围（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3胶浓度越大，越适宜分离的DNA越小

6xLoadingBuffer组成：EDTA30mM甘油（Glycerol）36%二甲苯青（XyleneCyanol）0.035%溴酚蓝（BromophenolBlue）0.05%本节课使用的上样缓冲液是TAKARA公司的6xLoading?Buffer，含有溴酚蓝和二甲苯蓝双指示剂系统。a.溴酚蓝（bromophenol?blue,?Bb）呈蓝紫色，约与300bp的DNA条带电泳速率相同；b.二甲苯青（xylene?cyanol,?Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢，约与4kb的DNA条带电泳速率相同。溴酚蓝二甲苯青

3.材料与方法（Materialsand?Methods）3.1实验材料（materials）质粒pXMCB-βB2βB2基因PCR产物琼脂糖粉末0.5%EB染色液DNA上样缓冲液（6xLoading?Buffer）5×TAE（Tris-醋酸及EDTA）电泳缓冲液：

3.2实验操作1.称取0.3g琼脂糖，倒入TAE/TBEbuffer后微波炉加热，每30s观察一下溶解情况。2.溶解的琼脂糖冷却至60℃,加入5μlEB,混匀后缓慢的将琼脂糖倒入制胶槽中，插入胶梳（该过程避免产生气泡）。

3.凝胶冷却聚合30分钟，移去胶梳，将整个凝胶底托转移置于电泳槽中。

4.向电泳槽中加入适量的1XTAE/TBE缓冲液，通常缓冲液在凝胶上方约1毫米处。

5.在塑料薄膜上加入2μLloadingbuffer和7μLDNA,混匀后，用移液器缓慢的将DNA样品加入琼脂糖凝胶的胶孔中(此过程应避免枪头中存有气泡).

6.以80mA电流电泳大约30min。

7.UVlight下观察DNA片段情况。

DNAMarker是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题，通过其大小可以粗略估算样品DNA分子量的大小应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。N3232L

4.实验结果绘制DNA琼脂糖凝胶电泳图谱正极负