感受态细胞的制备及重组质粒的转化.pptVIP

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重组质粒的转化experimentsofmolecularbiology重组DNA技术分：分离外源基因目的基因。切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。重组DNA技术的基本工具“分子运输车”限制性核酸内切酶DNA连接酶基因进入受体细胞的载体“分子缝合针”“分子运输车”“分子手术刀”受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞，即感受态细胞(competentcell)。感受态细胞(competentcell)转化（transformation）是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化的方法电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域；01此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；01经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。01转化原理（CaCl2法）转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。01CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。02制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15-30％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。03影响转化效率的因素影响因素细胞生长状态和密度杂菌和其它外源DNA的污染载体DNA及重组DNA受体细胞试剂的纯度和器皿的洁净度转化操作实验原理本实验以E.coliJM109菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。抗Amp宿主细菌含Amp培养基实验仪器、材料．超净工作台．高速离心机．恒温摇床．恒温培养箱．恒温水浴锅．制冰机．移液枪实验材料、试剂4．0.1mol/LCaCl2溶液含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50μg／mL）试管、培养皿重组质粒氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL）LB液体培养基3．1.5mL离心管，Tip头大肠杆菌JM109菌株实验安排1受体菌的培养感受态细胞的制备23质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化实验安排experimentsofmolecularbiologyexperimentsofmolecularbiology补充：移液枪的用法*