精氨酸转运RNA抑制因子通读ALS相关基因无义突变的实验研究.pdf

中文摘要

精氨酸转运RNA抑制因子通读ALS相关基因无义突变的

实验研究

摘要

目的：通过构建ALS相关基因的无义突变TBK1-R357X、FUS-R495X模

型，评估sup-tRNAArg对无义突变通读的疗效。

方法：

Arg

1．建立mCherry-R41X报告基因，分别与sup-tRNA1和2共转

染HEK293FT细胞，分析mCherry的荧光表达。

Arg

2．建立TBK1-R357X无义突变质粒，分别与sup-tRNA1和2共

转染HEK293FT细胞，分析GFP的荧光表达、TBK1全长蛋白表达，以

及无义突变位点的氨基酸类型。

Arg

3．建立FUS-R495X无义突变质粒，与sup-tRNA1共转染HEK293

FT细胞，分析GFP的荧光表达、FUS全长蛋白表达量，以及修复后FUS

无义突变聚集体的数量和大小。

4．建立F1代mFus-R487X杂合子小鼠，评估F2代小鼠生存、体

重表型，通过免疫组织化学和免疫荧光染色，分析FUS在脊髓中的定

位与定量分析。

5．对6月龄mFus-R487X杂合子和3月龄hFUS-R495X杂合子小

鼠进行足迹实验和转棒实验，分析在6个月、3个月是否出现运动神

经元病的临床表型。

结果：

ArgArg

1.sup-tRNA1、sup-tRNA2都恢复了mCherry-R41X报告基因的蛋

白表达，且S1、S2的荧光强度都较对照组显著提高，差别有统计学意义

（P＜0.001），其中S1、S2荧光强度相比差别无统计学意义

（ns=non-significant）。

ArgArg

2.sup-tRNA1、sup-tRNA2恢复了TBK1-R357X的无义突变，且

S1、S2的荧光强度较对照组都显著提高，差别有统计学意义（P＜0.05）；

WesternBlot显示TBK1-R357X修复后，S1相较于对照组蛋白质表达量提

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高了2.6倍，S2相较于对照组蛋白质表达量提高了2.1倍，差别有统计

Arg

学意义（P＜0.05）；sup-tRNA1使得正确修复精氨酸达到95.94%。

3.sup-tRNAArg1恢复了FUS-R495X的无义突变，S1组的荧光强度较

FUS-R495X组显著提高，差别有统计学意义（P＜0.001）；S1组使得在细

胞内产生的聚集体的面积相较于FUS-R495X组下降45%，差别有统计学意

义（P＜0.01）；S1组使得在细胞内产生的聚集体的数量相较于FUS-R495X

组下降2倍，差别有统计学意义（P＜0.05）；S1组相较于FUS-R495X组

CCK-8细胞增殖增加了9%，差别具有统计学意义（P＜0.01），减弱了FUS-R

495X对细胞增殖的毒性作用。

4.mFus-R487X纯合子小鼠出生48小时之内死亡，体重明显低于

mFus-R487X杂合子和野生型小鼠，差别具有统计学意义（P＜0.001）。

mFus-R487X纯合子小鼠脊髓中FUS蛋白在细胞质中错误定位，细胞内FU