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检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT

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检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT

摘要：犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种高度传染性的病毒，对犬类健康构成严重威胁。CDV存在强、弱毒株之分，对疫苗的免疫效果和疾病的治疗有重要影响。本研究旨在建立一种基于复合反转录-套式聚合酶链式反应（RT-nestedPCR）的方法，用于检测和鉴别CDV的强、弱毒株。通过优化引物设计和反应条件，该方法具有较高的特异性和灵敏度。实验结果表明，该方法能够有效地区分CDV强、弱毒株，为临床诊断和疫苗研发提供了有力工具。

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种属于副粘病毒科的单股负链RNA病毒，主要感染犬类，引起犬瘟热。CDV感染犬类后，可导致多种症状，包括发热、呼吸道症状、神经症状等，严重时可导致死亡。目前，全球范围内犬瘟热疫情仍然较为严重，因此，对CDV的检测和鉴别具有重要意义。CDV存在强、弱毒株之分，强毒株致病性强，而弱毒株致病性较弱。弱毒株疫苗在预防CDV感染中具有重要作用。然而，由于强、弱毒株的致病性差异，对疫苗的免疫效果和疾病的治疗有重要影响。因此，建立一种快速、准确、高效的CDV强、弱毒株检测方法，对于疾病防控和疫苗研发具有重要意义。本研究旨在建立一种基于复合反转录-套式聚合酶链式反应（RT-nestedPCR）的方法，用于检测和鉴别CDV的强、弱毒株。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括犬瘟热病毒强、弱毒株的RNA模板，这些病毒株分别来源于实验室保存的病毒库和临床分离的样本。其中，强毒株样本为临床诊断的典型病例，弱毒株样本为疫苗免疫后的健康犬只。为了确保实验结果的准确性，所有病毒株样本均经过严格的鉴定和测序确认，确保其纯度和特异性。此外，实验中还使用了多种阳性对照和阴性对照，以验证RT-nestedPCR方法的可靠性和稳定性。

(2)实验过程中，所使用的试剂包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、引物、缓冲液等。逆转录酶和DNA聚合酶均选用市售的高效、高纯度产品，以确保实验反应的顺利进行。dNTPs和引物则根据病毒基因序列设计合成，以保证引物的特异性和灵敏度。实验所用的缓冲液为优化后的PCR缓冲液，其中包含Mg2+、K+、(NH4)2SO4等成分，以提供最佳的反应条件。此外，实验还使用了去离子水、无核酸酶的酶反应板等辅助材料，以防止实验污染。

(3)实验仪器主要包括实时荧光定量PCR仪、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。实时荧光定量PCR仪用于实时监测PCR反应过程中DNA扩增的动态变化，以确保实验结果的准确性和重复性。离心机用于分离病毒RNA和提取病毒DNA，以获取高质量的模板。PCR仪用于扩增病毒基因片段，电泳仪和凝胶成像系统用于检测PCR产物，以验证实验结果。此外，实验过程中还使用了超净工作台、微波炉、移液器等辅助设备，以确保实验操作的规范性和安全性。

1.2引物设计与合成

(1)引物设计是RT-nestedPCR方法的关键步骤，旨在确保引物的特异性和灵敏度。在设计引物时，我们首先根据CDV强、弱毒株的基因序列，利用生物信息学软件进行比对分析，筛选出高度保守的序列区域。在此基础上，通过引物设计软件PrimerPremier5.0，设计了一对针对CDV强毒株的特异性引物（引物1和引物2）以及一对针对弱毒株的特异性引物（引物3和引物4）。引物1和引物2的长度分别为25和24碱基，引物3和引物4的长度分别为24和25碱基。引物设计时，确保了引物之间的错配率低于2%，以减少非特异性扩增。

(2)为了进一步验证引物的特异性和灵敏度，我们对设计的引物进行了体外扩增实验。实验中，分别以强毒株和弱毒株的RNA模板为模板，进行PCR扩增。结果表明，引物1和引物2能够特异性地扩增强毒株的基因片段，而引物3和引物4能够特异性地扩增弱毒株的基因片段。此外，我们还对引物进行了熔解曲线分析，结果显示引物与目标基因片段的结合温度（Tm）在60-70℃之间，符合PCR反应的要求。为了提高实验的灵敏度和特异性，我们对引物进行了优化，调整了引物的5端和3端的序列，以减少引物二聚体和非特异性扩增的发生。

(3)在引物合成过程中，我们采用了高纯度的引物合成试剂盒，确保了引物的纯度和质量。引物合成完成后，我们使用高效液相色谱（HPLC）对引物进行了纯度检测，纯度达到99%以上。为了验证引物的稳定性，我们对合