生物化学实验4 血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳.pptVIP

实验四血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳实验目的1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。

2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。醋酸纤维素薄膜：醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。实验原理电泳:带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于等电点不同而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此可使它们分离。影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120?m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白蛋白质名称等电点（pI）相对分子质量/Mr白蛋白α1－球蛋白α2－球蛋白β－球蛋白γ－球蛋白4.805.065.065.126.85~7.56900020000030000090000~150000156000~300000血清蛋白实验器材及试剂一、器材：醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（可用盖玻片或X胶片或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、烧杯、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽。二、试剂1、巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)：称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。2、氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B?0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏水至100ml。3、漂洗液:甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏水至100ml。?4、洗脱液:0.4mol/LNaOH溶液。5、透明液:称取柠檬酸21g，N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解并稀释至500ml。实验步骤1.?准备将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即?“滤纸桥”。1：滤纸桥2：电极缓冲液3：醋酸纤维素薄膜将醋酸纤维素薄膜切成2cm×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向下，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待充分浸透（约20min）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。2.点样?用加样器取少量血清(约2～3μl)，加在点样线上，待血清渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均匀的直线，并避免弄破薄膜.3.?平衡与电泳?将点样后的薄膜有光面朝上，点样的一端靠近负极，平直地贴于电泳槽支架的滤纸上，平衡约5分钟。盖上电泳槽盖，通电进行电泳。调节电压为100～160伏，电流0.4～0.6mA/cm宽，夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开2.5～3.5cm时断电。4.?染色??用无齿镊小心取出薄膜，浸于染色液中1～3分钟（以清蛋白带染透为止）。染色过程中应轻轻晃动染色皿，使薄膜与染色液充分接触，薄膜量较多时，应避免彼此紧贴而影响染色效果。5.?漂洗??准备3个培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中连续浸洗数次，直至背景无色为止。将漂净的薄膜用滤纸吸干，从正极端起依次为清蛋白（A）、α1、α2、β及γ-球蛋白。6.定量??（1）洗脱法：取6支试