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CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法的建立

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CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法的建立

摘要：本研究旨在建立一种基于CFSE（Carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester）检测的马传染性贫血病毒（MareErythopoieticAnemiaVirus,MEEV）疫苗免疫马T细胞增殖的方法。通过优化实验条件，成功建立了CFSE标记的马T细胞增殖检测系统，并对MEEV疫苗免疫马T细胞的增殖能力进行了评估。实验结果表明，该方法具有较高的灵敏度和特异性，为MEEV疫苗免疫效果的评估提供了一种有效手段。本研究为MEEV疫苗的免疫学研究和临床应用提供了理论依据和技术支持。

马传染性贫血病毒（MareErythopoieticAnemiaVirus,MEEV）是一种引起马类发生严重贫血和免疫抑制的病毒性疾病。目前，MEEV疫苗的研究已成为兽医科学领域的重要课题。疫苗免疫效果的评估是疫苗研发过程中的关键环节。T细胞增殖试验是评价疫苗免疫效果的重要指标之一。本研究旨在建立一种基于CFSE检测的马T细胞增殖方法，为MEEV疫苗免疫效果的评估提供一种新的技术手段。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括马源T细胞、马传染性贫血病毒疫苗、CFSE荧光染料、RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合抗生素、淋巴细胞分离液、酶联免疫检测仪、流式细胞仪、离心机、细胞培养箱、显微镜等。实验所用马源T细胞来自健康马匹，通过无菌采集血液，采用淋巴细胞分离液进行分离纯化，随后在含有10%胎牛血清和青霉素-链霉素混合抗生素的RPMI-1640培养基中进行培养。CFSE荧光染料用于标记T细胞，通过荧光显微镜观察染料标记效果，确保染料与细胞膜结合良好。酶联免疫检测仪用于检测细胞增殖情况，而流式细胞仪则用于分析T细胞的亚群分布。

(2)实验过程中使用的马传染性贫血病毒疫苗为我国自主研发的灭活疫苗，经动物实验验证具有良好的免疫原性和安全性。疫苗制备过程中，采用病毒感染马肾细胞，收集病毒颗粒，经过灭活处理得到疫苗。在实验中，将疫苗按照说明书推荐剂量加入细胞培养基中，培养24小时，使T细胞暴露于疫苗抗原。

(3)实验所需仪器设备均经过严格校准和验证，确保实验结果的准确性。酶联免疫检测仪的检测范围为1-10000细胞数/孔，具有高灵敏度和高重复性。流式细胞仪的检测范围为10^5-10^7细胞/次，可同时检测多种荧光标记的细胞，为细胞增殖和亚群分析提供可靠的数据支持。此外，实验过程中还使用了细胞培养箱、离心机等设备，确保细胞在适宜的条件下生长和分离。

1.2实验方法

(1)马源T细胞的分离与培养：首先，无菌采集健康马匹的血液，使用淋巴细胞分离液进行分层，通过密度梯度离心分离出单个核细胞。收集单个核细胞，用RPMI-1640培养基洗涤后，加入红细胞裂解液处理，去除红细胞。处理后的细胞再次洗涤，以去除残留的红细胞裂解液。将处理后的细胞以1×10^6细胞/毫升的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37°C、5%CO2的培养箱中培养24小时，以促进细胞贴壁。

(2)CFSE标记T细胞：在细胞贴壁后，将细胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤两次，然后按照CFSE染料说明书进行染料稀释。将稀释后的染料加入细胞中，避光孵育30分钟。孵育结束后，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，以去除未结合的染料。洗涤后的细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，备用。

(3)T细胞增殖试验：将CFSE标记的T细胞分为两组，分别加入马传染性贫血病毒疫苗和阴性对照（不含疫苗的培养基）。每组细胞均设复孔，每孔加入100μl细胞悬液。将细胞培养板置于37°C、5%CO2的培养箱中培养72小时。培养结束后，收集细胞，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤两次，重悬细胞。使用酶联免疫检测仪检测细胞增殖情况，以刺激组与阴性对照组的吸光度比值表示细胞增殖能力。通过流式细胞仪检测T细胞的亚群分布，分析细胞增殖与亚群之间的关系。

1.3数据分析

(1)数据收集：采用酶联免疫检测仪对T细胞增殖试验的结果进行定量分析，通过测量各组细胞的吸光度值，计算出刺激组与阴性对照组的吸光度比值，作为细胞增殖能力的指标。同时，利用流式细胞仪对T细胞亚群进行检测，记录不同亚群的细胞比例。

(2)数据处理：将实验数据输入统计分析软件进行数据处理。首先，对吸光