细胞融合与体细胞杂交.pptVIP

（4）分离、鉴定与活力分析（1）分离飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。沉降法：低速离心，收集沉淀。不连续梯度法:*无菌下，浓度较高溶液（如20%蔗糖溶液）加入离心管加入原生质体混合液封口后，离心，原生质体漂浮在上面用吸管收集原生质体液面，放入液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次将原生质体悬浮在液体培养基中备用飘浮法*将原生质体悬浮在液体培养基中备用除去未消化的组织细胞弃去上清液和酶液微孔滤膜过滤酶混合液使原生质体沉淀液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次低速离心3-5min沉降法*01不连续梯度法添加标题02离心管中配制成不同的浓度梯度添加标题03加入原生质体混合液添加标题04离心5min，原生质体位于某一浓度梯度，用吸管收集添加标题05液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次添加标题06将原生质体悬浮在液体培养基中备用添加标题*叶片原生质体分离纯化流程图*鉴定与活力分析低渗爆破法：爆破后是无形的。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色法：有活力的原生质体吸收不同染料显示与死亡细胞不同的颜色来分析。FDA（二乙酸荧光素）能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性*酚藏花红染色法（0.1%)酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。 氧电极法：有活力原生质体光照下放出氧气，黑暗耗氧气 关键：细胞核的融合*1.生物法病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。*五细胞融合方法#2022*原理与过程足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用，使细胞聚集在一起。通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏，不同细胞间形成通道，细胞质流通并融合（病毒也随之进入细胞质）。有丝分裂，细胞核融合，形成杂种细胞。2化学法*NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。可以采用的化学诱导剂包括：细胞膜电荷平衡被打破。*（1）NaNO3诱导融合211909年，凯斯特（Kuster）发现机械分离的发生了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶液中可以恢复并伴随着细胞融合。NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚集，促进细胞融合。NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%。1972年，卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界第一株体细胞杂种。3（2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合*1973年，凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers）发现采用强碱性（例如pH10.5）的高浓度钙离子溶液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下处理两个品系的烟草叶肉原生质体，很容易促使融合，融合率可以达到10%。钙离子中和原生质体膜或细胞膜表明表面电荷，使彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH能改变质膜的表面电荷，利于细胞融合。（3）PEG诱导*聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在200－20,000之间，分子量1,000以下者为液体，1,000以上者为固体。PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生