DB32T 1738-2011 草鱼出血病病毒(GCHV)逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法　　.docxVIP

ICS65.150

B52

备案号：

DB32

江苏省地方标准DB32/T1738—2011

草鱼出血病病毒（GCHV）逆转录—聚合酶

链式反应(RT-PCR)检测方法

Testmethodofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)

forGrassCarpHemorrhageVirus(GCHV)

2011-04-15发布2011-06-15实施

江苏省质量技术监督局发布

I

DB32/T1738—2011

前言

本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准化的结构和编写规则》的规定编写。

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由江苏省海洋与渔业局提出。

本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：陈辉、邹勇、李婧慧、段翠兰、方苹、刘训猛、倪金俤、王习达、陈静、陈光芸、郭立新。

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DB32/T1738—2011

草鱼出血病病毒（GCHV）逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法

1范围

本标准规定了细胞分离病毒后，用PCR技术诊断草鱼出血病病毒的方法。

本标准适用于草鱼出血病病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本部分。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本部分。

SC/T7103-2008水生动物产地检疫采样技术规范GB/T15805-2008鱼类检疫方法

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3试剂和材料

3.1水

应符合GB/T6682-2008中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用DEPC处理以除掉RNA酶

3.2GCHV标准株3.3Taq酶

-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4逆转录酶AMV

10U/mL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

3.5RNA抑制剂(RNasin)

20U/μL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

3.6dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmoL/L)3.7引物

试验用到的一对引物，其扩增出的片段为455bp，其序列如下：F：5’-CGCTTCGCTGTTTATGC-3’

R：5’-TTATCAGGTGCCCAGTTTT-3’

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DB32/T1738—2011

3.8无水乙醇

分析纯，使用前预冷到-20℃。3.9矿物油

要求无DNA酶和RNA酶。

4器材和设备

4.196孔细胞培养板。

4.2倒置显微镜。4.3恒温培养箱。

4.4普通冰箱和低温冰箱。

4.5组织研磨工具。

4.6离心机和离心管。

4.7PCR扩增仪。4.8电泳仪。

4.9微量移液器及吸头。4.10凝胶成像系统。

5GCHV病毒的分离

5.1采样

对有临床症状的鱼，如是体长小于等于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取内脏(包括肾);体长大干6cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织。按SC/T7103-2008采样。

5.2样品处理

应在10℃以下。先用组织研磨工具将样品组织匀浆成糊状，再按1:10的最终稀释度重悬于培养液中.如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有100U/mL双抗（青霉素、链霉素）的培养液中，于15℃下孵育2h-4h或4℃下孵育6h～24h,差速离心：9000r/min5min，12000r/min15min,收集上清液。

5.3病毒分离

对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1:10,1:100和1:10003个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24h的CIK细胞单层中，每孔(2cm2)的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃-20℃吸附0.5h～lh后，加人细胞培养液。置于24℃士1℃培养。试验中要设有阳性对照(接种GCHV标准株)，和空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行PCR鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细