T_SDVMA 005-2024 鉴别羊小反刍兽疫IV 系与疫苗毒株的荧光RT-PCR 方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准T/SDVMA005-2024

鉴别羊小反刍兽疫IV系与疫苗毒株的荧光RT-PCR方法

AfluorescenceRT-PCRmethodfordistinguishingovineruminantdiseaseIVstrainvirusfromvaccinevirus

2024-12-12发布2024-12-12实施

山东省兽医协会发布

T/SDVMA005—2024

Ⅰ

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的

规则起草。

本文件由山东省兽医协会提出并归口。

本文件起草单位：山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司、深圳市康百得生物科技有限公司。

本文件主要起草人：王金良、孟卫芹、姚春阳、莫玲、邓凤林、徐倩倩、陈金龙、徐晴晴、唐娜、郭时金、胡绍良。

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鉴别羊小反刍兽疫IV系与疫苗毒株的荧光RT-PCR方法

1范围

本文件规定了羊小反刍兽疫IV系与疫苗毒株（Clone9株）SYBRGreenI荧光RT-PCR鉴别检测要求。

本文件适用于羊小反刍兽疫IV系与疫苗毒株（Clone9株）的鉴别检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试验原理

SYBRGreenI是一种只与双链DNA小沟结合的染料。在RT-PCR反应体系中，采用特异的引物，将RNA逆转录形成cDNA，当SYBRGreenI荧光染料与cDNA双链结合时，荧光信号增强，从cDNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。与此同时，随温度升高，DNA的双螺旋结构发生降解，全部DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系，通过Tm值的差异可以实现对扩增产物的鉴别。

5试剂或材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯。

5.1水，GB/T6682，一级。

5.2焦碳酸二乙酯（DEPC）水：取1mLDEPC加入水至1000mL，充分震荡混匀，静置24h后，

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121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

5.3磷酸盐缓冲溶液（PBS）：取Na2HPO4?12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mL水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

5.4引物：引物名称和序列见附录A。

5.5商品化病毒核酸提取试剂盒。

5.6商品化一步法荧光RT-PCR反应试剂。

5.7小反刍兽疫疫苗毒株阳性对照：市售商品化小反刍兽疫弱毒疫苗。

5.8小反刍兽疫疫苗毒株阴性对照：DEPC水。

5.9小反刍兽疫IV系毒株阳性对照：含有小反刍兽疫IV系毒株扩增目的基因的DNA质粒。

5.10小反刍兽疫IV系毒株阴性对照：DEPC水。

6仪器设备

6.1二级生物安全柜。

6.2荧光PCR仪。

6.3电子天平：精度0.01g。

6.4高速冷冻离心机：可控温至4℃,转速≥12000r/min。

6.5超低温冰箱：可控温至-70℃以下。

6.6高压蒸汽灭菌器。

7样品

7.1采样

7.1.1采样注意事项：采样过程中应按照NY/T541执行，采样及样品处理过程中做好个人防护，样品间不得交叉污染。

7.1.2样品采集：发病羊只采集眼结膜拭子2个、鼻黏膜拭子2个、颊部拭子